發(fā)布時間：2018-04-01 03:30

  本文選題：puma　切入點：凋亡　出處：《昆明醫(yī)學院》2011年碩士論文

【摘要】：目的探討puma(p53 up-regulated modulator of apoptosis)基因突變、mRNA表達與皮膚基底細胞癌的相關(guān)性。 方法通過對實驗條件的探討,優(yōu)化并最終確立了puma基因三個高GC含量外顯子的擴增條件；建立了實時熒光定量RT-qPCR檢測puma mRNA的表達情況的方法。 結(jié)果 1.通過對實驗條件的摸索,確立了puma基因三個外顯子的最終擴增條件,分別如下： (1)外顯子2(Exon2)的反應體系：2×Mastermix 25μl,上下游引物(10μmol/L)各1.25μl,模板DNA 2.5μl, ddH2O 20μl,總體積50μL。反應條件為95℃預變性5min,95℃45sec、70℃45sec、72℃45sec,循環(huán)33次,最后72℃延伸5min。 (2)外顯子3(Exon3)的反應體系：上下游引物(10μmol/L)各1.3μl,模板DNA2.5μl, ddH2O 19.9μl,其余組分和外顯子2相同。反應條件為95℃預變性5min,95℃45sec、66℃45sec、72℃45sec,循環(huán)33次,最后72℃延伸5min。 (3)外顯子4(Exon4)的反應體系：上下游引物(10μmol/L)各0.9μl,模板DNA2.5μl, ddH2O 20.7μl,其余組分和外顯子2相同。反應條件為95℃預變性5min,95℃45sec、59℃45sec、72℃45sec,循環(huán)33次,最后72℃延伸5min。 2.應用優(yōu)化后的擴增體系和條件對24例面部皮膚基底細胞癌組織以及7例面部正常組織的puma基因外顯子2～4進行了PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)測序檢測是否有突變,經(jīng)Blast 2序列比對分析,未發(fā)現(xiàn)任何突變。 3.通過T載體克隆方法成功構(gòu)建pMD18-T(+)/puma和pMD18-T(+)/GAPDH重組質(zhì)粒,并通過對實驗條件的摸索,建立實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測puma mRNA的方法。實時熒光定量法檢測puma mRNA的反應體系：2×SYBR premix 10μl,上下游引物(10μmol/L)各0.4μl,ROX 0.4μl,cDNA 1.0μl,滅菌水7.8μl,總體系20μl。擴增條件：95℃預變性5 min,95℃變性10 sec,60℃退火5 sec,72℃延伸10 sec,5個循環(huán)(不測熒光),95℃變性10 sec,60℃退火5sec,72℃延伸10 sec,78℃2 sec,72℃延伸30 sec,40個循環(huán)(測熒光),終末65℃延伸5 min。內(nèi)參GAPDH體系同上,擴增條件：95℃預變性5 min,95℃變性15 sec,64℃退火5 sec,72℃延伸10 sec,5個循環(huán),95℃變性15 sec,64℃退火5 sec,72℃延伸10 sec,78℃3 sec,72℃延伸30 sec,40個循環(huán)(測熒光),終末65℃延伸5 min。 4.采用校正曲線法檢測puma mRNA的相對表達量,puma mRNA在癌組織和正常對照組中均有表達,puma mRNA表達量在基底細胞癌組織和正常對照組織的表達量差別有統(tǒng)計學意義,癌組織puma mRNA表達量低于正常組織(P0.05)。 結(jié)論 1.puma基因外顯子2～4的編碼序列保守且穩(wěn)定。 2.puma mRNA的相對表達量在基底細胞癌組織和正常組織中存在差異,且在基底細胞癌組織中的相對表達量低于正常組織。
[Abstract]:Objective to investigate the relationship between the expression of puma(p53 up-regulated modulator of apoptosismRNA and basal cell carcinoma of skin. Methods the conditions for amplification of three exons with high GC content of puma gene were optimized and finally established, and a real-time fluorescent quantitative RT-qPCR method for detecting the expression of puma mRNA was established. Results. 1. The final amplification conditions of three exons of puma gene were established by exploring the experimental conditions, which were as follows:. The reaction system was: 2 脳 Mastermix 25 渭 l, 10 渭 mol / L of upstream and downstream primer, 2.5 渭 l of template DNA, 20 渭 l of ddH2O, and 50 渭 L of total volume. The reaction conditions were as follows: predenaturation at 95 鈩，

本文編號：1693782