本文關(guān)鍵詞：microRNA-217對人皮膚成纖維細胞衰老的作用及機制研究　出處：《中南大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：生物體衰老是一個包含不同器官和系統(tǒng)的、發(fā)生一系列特定變化的復雜過程。皮膚衰老是機體衰老最直接的表現(xiàn),本質(zhì)和基礎(chǔ)是皮膚細胞的衰老,其不僅受控于遺傳基因的調(diào)節(jié),也受控于表觀遺傳的調(diào)控,后者是衰老發(fā)生的重要機制,包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑及microRNA (miRNA)調(diào)控等。 miRNA-217是一種已知高表達于人臍靜脈內(nèi)皮細胞及人冠狀動脈內(nèi)皮細胞中的miRNA,已被證實其在胰腺導管腺癌中能通過靶向調(diào)控KRAS起到腫瘤抑制因子的作用,還可靶向調(diào)節(jié)Runx2,從而影響成骨細胞成熟。在衰老機制的研究中,已有報道顯示,miR-217在衰老的血管內(nèi)皮細胞中表達上調(diào),并可通過抑制長壽基因Sirt1的表達導致血管內(nèi)皮細胞的衰老。然而,至目前為止,miR-217對于皮膚衰老的作用研究還不清楚。本課題組前期通過miRNA芯片發(fā)現(xiàn)傳代衰老組與年青組人皮膚成纖維細胞(Human skin fibroblasts, HSF)比較,miR-217的表達量明顯增加。因此,我們推測miR-217可能在HSF衰老中起到了重要作用。 本研究通過三個部分證實miR-217在HSF衰老中的作用機制。第一部分：檢測比較年青組與衰老組HSF中miR-217的表達。第二部分：研究miR-217在HSF衰老過程中的作用。通過在年青組HSF中過表達miR-217并檢測細胞衰老的表型及相關(guān)衰老蛋白的表達,以探討miR-217在細胞衰老中的作用。第三部分：研究miR-217調(diào)控HSF衰老的機制：(1)通過生物信息學預測,發(fā)現(xiàn)miR-217可能直接靶向DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1),利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)證明兩者的直接靶向關(guān)系；(2)在HSF中,檢測miR-217對DNMT1表達量的調(diào)節(jié),及其通過DNMT1對細胞衰老調(diào)節(jié)的機制。 通過以上研究揭示miR-217能夠通過下調(diào)DNMT1來促進HSF的衰老,為皮膚衰老的研究和治療領(lǐng)域提供新的方向。 第一部分年青組與衰老組人皮膚成纖維細胞中miR-217的表達目的：檢測自然衰老與傳代衰老HSF中miR-217的表達水平。 方法：收取少年組(10歲)、中年組(30～50歲)與老年組(60歲)的正常人避光部位皮膚,原代培養(yǎng)HSF,并將少年組HSF進行傳代(年青組：P3-5,衰老組：P20-25),采用Real-time PCR方法檢測miR-217的表達量。 結(jié)果：和少年組細胞比較,中年組、老年組HSF中的miR-217表達量明顯升高(中年組：P0.05,老年組：P0.01),其中老年組較中年組細胞中miR-217的表達量也顯著升高(P0.01)。和年青組細胞比較,傳代衰老組細胞的miR-217的表達量亦明顯升高(P0.01)。 結(jié)論：自然衰老與傳代衰老的HSF中miR-217的表達明顯上升。 第二部分miRNA-217對人皮膚成纖維細胞衰老的作用 目的：研究miR-217在HSF衰老過程中的作用。 方法：在年青組HSF中,通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hsa-miR-217的慢病毒和陰性對照慢病毒,48小時后,采用Real-time PCR方法檢測miR-217的表達量,MTT法檢測HSF細胞增殖能力,衰老β-半乳糖苷酶染色法檢測HSF的衰老相關(guān)染色率,western blot法檢測衰老相關(guān)蛋白P53、P21、sirt1等的改變。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染hsa-miR-217的慢病毒后,HSF中的miR-217表達量顯著上調(diào)(P0.01),細胞增殖能力明顯下調(diào)(P0.05),衰老β-半乳糖苷酶染色率明顯上升(P0.01),衰老相關(guān)蛋白P53、P21的表達量上升、sirt1表達量下降(P0.05)。 結(jié)論：過表達miR-217可明顯促進HSF的衰老,miR-217在HSF的衰老過程中起到重要作用。 第三部分miRNA-217直接調(diào)控HSF中DNMT1的表達及機制 目的：研究miR-217在HSF衰老過程中的調(diào)控機制。 方法：通過MICRORNA.ORG網(wǎng)站預測DNMT1是否為hsa-miR-217可能的直接靶向基因,并構(gòu)建DNMT1的3'UTR區(qū)域的野生型與突變型的熒光素酶報告基因質(zhì)粒,在293T細胞中,分別轉(zhuǎn)染野生型與突變性DNMT1-3'UTR質(zhì)粒,4小時后將miR-217化學模擬物(mimics)轉(zhuǎn)染細胞,48小時后溶解細胞,熒光素酶檢測系統(tǒng)分析熒光強度。構(gòu)建含DNMT1shRNA序列的慢病毒載體,通過在年青組HSF中抑制DNMT1的表達量來檢測HSF的衰老表型。利用第二部分中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的年青組HSF,提取細胞總蛋白,利用western blot法檢測DNMT1的蛋白表達量,并在過表達miR-217的年青組HSF中,轉(zhuǎn)染DNMT1-cDNA質(zhì)粒,衰老β-半乳糖苷酶染色法檢測HSF的衰老相關(guān)染色率。 結(jié)果：MICRORNA.ORG網(wǎng)站預測到miR-217的3'UTR區(qū)域可以直接靶向DNMT1的序列。熒光素酶報告基因檢測顯示,野生型的DNMT1-3'UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,過表達miR-217后,熒光量較未過表達組下降(P0.05),而突變型的DNMT1-3'UTR轉(zhuǎn)染組未發(fā)生明顯變化。年青組HSF中抑制DNMT1的表達量后,細胞增殖能力明顯減弱(P0.05),衰老β-半乳糖苷酶染色率明顯上升(P0.01)；年青組HSF中過表達miR-217后,DNMT1的蛋白表達量明顯下降(P0.01)；同時轉(zhuǎn)染含hsa-miR-217shRNA和DNMT1-shRNA序列的慢病毒載體后,較單獨下調(diào)hsa-miR-217組,衰老β-半乳糖苷酶染色率上升(P0.05)。 結(jié)論：DNMT1是miR-217的調(diào)控的靶基因,miR-217可直接靶向結(jié)合DNMT1的3'UTR區(qū)；傳代衰老的HSF中DNMT1表達量明顯下降,抑制DNMT1的表達量后,可以明顯促進HSF的衰老；miR-217通過抑制DNMT1的表達量從而促進HSF的衰老。
[Abstract]:Biological aging is a complex process that contains different organs and systems and has a series of specific changes. Skin aging is the most direct manifestation of aging, is the essence and basis of the aging of skin cells, the regulation is not only controlled by genes, also controlled by epigenetic regulation, which is an important mechanism of aging, including DNA methylation, histone modification, chromatin remodeling and the regulation of microRNA (miRNA).
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R751

【參考文獻】

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1 劉萃萃;王璐璐;趙衛(wèi)衛(wèi);彭攸;王玉平;孫振亮;馮景;;miRNAs慢病毒文庫篩選靶向EZH23'非翻譯區(qū)的新型miRNAs及其在乳腺癌中的表達[J];南方醫(yī)科大學學報;2014年03期

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本文編號：1343232