發(fā)布時(shí)間：2017-12-01 13:24

  本文關(guān)鍵詞：miR-122-5p通過靶向Sprouty2在IL-22介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖中的作用

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【摘要】：目的：本研究利用miRNA以及mRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)IL-22介導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞中miRNAs及mRNAs的表達(dá)差異,從表觀遺傳學(xué)角度進(jìn)一步探究IL-22在誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖中的分子機(jī)制。方法：(1)以人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞株)作為研究對(duì)象,實(shí)驗(yàn)組給予IL-22 (100 ng/ml)刺激24h,對(duì)照組不予刺激,分別進(jìn)行2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。Trizol法提取細(xì)胞總RNA,采用Invitrogen公司microRNA芯片4.0技術(shù)及mRNA表達(dá)譜芯片2.0技術(shù),篩選差異表達(dá)的miRNAs及]mRNAs分子；(2)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)進(jìn)行miRNA芯片結(jié)果驗(yàn)證,以U6作為內(nèi)參照,所得數(shù)據(jù)以2--ct表示；RT-qPCR法檢測(cè)6例尋常型銀屑病患者皮損及6例正常對(duì)照者皮膚組織中該miRNA分子的表達(dá)情況；(3)兩芯片結(jié)果中呈負(fù)相關(guān)的交集基因即為miRNA可能調(diào)控的下游靶基因,進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析及查閱文獻(xiàn)的方法尋找該miRNA的下游靶基因。將預(yù)測(cè)的靶基因采用RT-qPCR方法,在IL-22刺激24h后的HaCaT細(xì)胞中進(jìn)行差異驗(yàn)證,以β-actin作為內(nèi)參照；免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)靶基因在6例尋常型銀屑病患者皮損及正常對(duì)照者皮膚組織石蠟切片中的表達(dá)變化；(4)為驗(yàn)證該差異miRNA分子的生物學(xué)功能,在HaCaT細(xì)胞中,通過分別轉(zhuǎn)染其模擬物、抑制物以及各自的對(duì)照組進(jìn)行CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)；(5)通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)以及Western Blot實(shí)驗(yàn),進(jìn)行靶基因的驗(yàn)證。結(jié)果：(1)miRNA及mRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示：表達(dá)上調(diào)2倍及以上的miRNAs共15個(gè),表達(dá)下調(diào)2倍及以上的miRNAs共5個(gè),預(yù)測(cè)miRNA-122-5p的靶基因共7個(gè)；(2) RT-qPCR結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,IL-22刺激HaCaT細(xì)胞24h后miR-122-5p表達(dá)顯著上調(diào)(約3.50倍,P0.05),在6例尋常型銀屑病患者皮損中miR-122-5p同樣表達(dá)上調(diào)(約2.26倍,P0.05)；(3)靶基因表達(dá)情況驗(yàn)證：結(jié)合生物信息學(xué)分析方法,我們確定Sprouty2 (Spry2)作為下游靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。RT-qPCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,IL-22刺激HaCaT細(xì)胞24h后Spry2蛋白表達(dá)下調(diào)(約1.72倍,P0.05)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,6例尋常型銀屑病患者皮損中Spry2蛋白表達(dá)降低(P0.05)；(4)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染niR-122-5p模擬物組,HaCaT細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P0.05),而轉(zhuǎn)染miR-122-5p抑制物組,細(xì)胞增殖能力則受到明顯的抑制(P0.05)。(5)靶基因Spry2驗(yàn)證結(jié)果：分別將構(gòu)建好的攜帶有Spry2基因3'UTR區(qū)野生型或突變型的報(bào)告基因載體,與miR-122-5p模擬物或?qū)φ瘴锕餐D(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染Spry2野生型報(bào)告基因載體及miR-122-5p模擬物組,其熒光素酶活性顯著降低(P0.05),而轉(zhuǎn)染突變型報(bào)告基因載體與miR-122-5p模擬物組,其熒光素酶活性未見明顯變化(P0.05)。Western Blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染miR-122-5p模擬物組,Spry2蛋白表達(dá)顯著降低,而轉(zhuǎn)染miR-122-5p抑制物組Spry2蛋白表達(dá)增加(P0.05),以上結(jié)果提示Spry2是miR-122-5p的直接靶基因。結(jié)論: miR-122-5p在IL-22刺激后的角質(zhì)形成細(xì)胞中以及尋常型銀屑病患者皮損中均表達(dá)上調(diào)；過表達(dá)miR-122-5p在HaCaT細(xì)胞中有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,而抑制miR-122-5p的表達(dá),則HaCaT細(xì)胞的增殖能力明顯減弱；Spry2是miR-122-5p調(diào)控的直接靶基因。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R758.63

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本文編號(hào)：1241264