本文關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌感染與慢性自發(fā)性蕁麻疹發(fā)病相關(guān)性及其作用機制的研究

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【摘要】：研究背景慢性蕁麻疹(Chronic urticaria,CU)是一類皮膚科常見疾病,臨床癥狀表現(xiàn)為全身或局部反復發(fā)作的風團伴瘙癢,病程常持續(xù)6周以上。其致病因素常復雜且隱匿,臨床上將大多數(shù)無明顯外部致病因素的慢性蕁麻疹患者(80%)劃歸為慢性自發(fā)性蕁麻疹(Chronic spontaneous urticaria,CSU)。近年來,很多研究數(shù)據(jù)表明,CSU患者人群常伴有高的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染率,并且經(jīng)規(guī)范的抗幽門螺桿菌治療后,大部分患者蕁麻疹癥狀可得到有效緩解,這也揭示了幽門螺桿菌感染和CSU發(fā)病有密切相關(guān)性。普遍認為,蕁麻疹發(fā)病機制的始動環(huán)節(jié)是肥大細胞的異常激活,而此事件中肥大細胞的活化,常常是由其細胞膜上的高親和力FcεRI受體和IgE(Immunoglobulin E)抗體病理性交聯(lián)觸發(fā)。盡管已有研究在個別CU病例中檢測出血清特異性抗幽門螺桿菌IgE抗體,但由于感染幽門螺桿菌后引起機體的Th1(T-helper type 1,Th1)型免疫反應常優(yōu)于Th2(T-helper type 1,Th2)型免疫反應,并且這些病例中檢測出的血清特異性抗幽門螺桿菌Ig E抗體處于低滴度水平,這都提示Ig E介導的肥大細胞活化效應不是幽門螺桿菌相關(guān)性蕁麻疹的主要致病機制。鑒于肥大細胞膜上存在多種正性調(diào)節(jié)受體,除了對Ig E抗體高親和力的FcεRI受體外,低親和力的Ig G受體、循環(huán)免疫復合物受體、補體受體或Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)等的特異性結(jié)合也可能導致肥大細胞的活化。有個別研究指出,在伴幽門螺桿菌感染的CU患者血清中,可以檢測出高水平的特異性抗幽門螺桿菌或其脂蛋白Lpp20的IgA和IgG抗體,但針對大樣本的CSU患者血清中抗幽門螺桿菌及其蛋白成分抗體水平的調(diào)研鮮有報道,細菌特異性抗體與CSU發(fā)病的相關(guān)性及可能機制有待進一步驗證和明確。盡管某些研究顯示,幽門螺桿菌不能直接激活大鼠的肥大細胞,但這種直接激活效應并未在人的肥大細胞上得到評估。雖然近年來一些研究表明,某些幽門螺桿菌蛋白如空泡毒素(Vacuolating cytotoxin A,VacA)和中性粒細胞激活蛋白(neutrophil-activatingprotein,nap),能夠直接激活肥大細胞,這提示幽門螺桿菌極有可能通過直接作用的方式激活肥大細胞,參與cu的病程,但目前的相關(guān)研究仍停留在極個別蛋白與肥大細胞作用水平,幽門螺桿菌對肥大細胞的激活作用尚缺乏系統(tǒng)性的分析和研究。目的1.探討幽門螺桿菌感染和csu發(fā)病是否存在相關(guān)性;2.檢測csu病例血清中抗幽門螺桿菌全菌抗原及其lpp20脂蛋白特異性ige、igg、iga抗體水平,探討其是否與csu發(fā)病存在相關(guān)性及可能的致病機制;3.探討幽門螺桿菌全菌制劑及其蛋白組分是否對人lad2肥大細胞株有直接活化作用,篩選出作用最強的蛋白組分并評價其激活效力,進一步明確其具體組成成分。材料方法1.采用elisa方法檢測csu患者和非蕁麻疹健康對照組血清抗幽門螺桿菌igg抗體陽性率,判定幽門螺桿菌感染和csu發(fā)病相關(guān)性;2.表達、純化、鑒定重組lpp20脂蛋白并制備尿素裂解的幽門螺桿菌全菌抗原,采用elisa法分別檢測csu患者及非蕁麻疹健康對照組中血清特異性抗幽門螺桿菌全抗原及抗lpp20蛋白的ige、igg、iga抗體水平;3.制備幽門螺桿菌尿素裂解液、幽門螺桿菌超聲粉碎上清、福爾馬林滅活幽門螺桿菌三種全菌制劑,將三種細菌全菌制劑同人lad2肥大細胞體外共培養(yǎng),用甲苯胺藍染色法及β-氨基己糖苷酶釋放率評價三種幽門螺桿菌全菌制劑對人lad2肥大細胞株的直接活化作用;4.利用分子篩分離制備30個連續(xù)分子量梯度的幽門螺桿菌混合蛋白組分(mixed-proteincomponents,pcs),將制備好的混合蛋白組分分別同人lad2肥大細胞株共培養(yǎng),用β-氨基己糖苷酶釋放率評價不同蛋白組分對肥大細胞的直接活化作用并篩選出激活效力最強的混合蛋白組分;5.將篩選出的優(yōu)勢性混合蛋白組分pc17與人lad2肥大細胞株共培養(yǎng),用elisa法檢測β-氨基己糖苷酶、組胺、tnf-α、il-3、il-4、il-17、ifn-γ及l(fā)tb4釋放情況,評價其對肥大細胞的劑量依賴性和時間依賴性活化效力;6.用酶消化法從sds-page電泳凝膠上切下并處理pc17混合蛋白組分條帶,用液相色譜-質(zhì)譜(lc-ms/ms)串聯(lián)分析方法明確pc17的具體組成成分。結(jié)果1.csu患者的血清特異性抗幽門螺桿菌igg抗體陽性率(73.46%,155/211)顯著高于無蕁麻疹正常對照組(51.82%,71/137)(χ2=17.08,p0.001);2.伴幽門螺桿菌感染的csu患者血清特異性抗幽門螺桿菌全抗原ige(0.082±0.002)、igg(1.053±0.022)、iga(0.660±0.022)抗體水平并未高于伴幽門螺桿菌感染的非蕁麻疹對照組(ige0.078±0.003,igg1.222±0.034,iga0.849±0.037);3.伴幽門螺桿菌感染的csu患者血清特異性抗lpp20脂蛋白ige(0.085±0.003)、igg(1.459±0.012)、iga(1.229±0.020)抗體水平并未高于伴幽門螺桿菌感染的非蕁麻疹對照組(ige0.082±0.005,igg1.494±0.016,iga1.251±0.033);4.β-氨基己糖苷酶釋放實驗顯示,幽門螺桿菌尿素裂解液、幽門螺桿菌超聲粉碎上清以及福爾馬林滅活幽門螺桿菌在體外共培養(yǎng)體系中均能有效活化一定濃度的lad2肥大細胞,其β-氨基己糖苷酶釋放率分別與陰性對照組比較,p0.05,其活化作用隨著工作濃度增大而增加;甲苯胺藍染色實驗表明,肥大細胞脫顆粒數(shù)量隨著幽門螺桿菌制劑刺激濃度的增加而增大,并且各菌液處理組中的肥大細胞脫顆粒率變化趨勢基本同其β-氨基己糖苷酶釋放率變化趨勢一致;5.通過分子篩層析法,幽門螺桿菌尿素裂解液被成功分成30個連續(xù)分子量梯度的混合蛋白組分(pcs)。通過比較這30個組分促肥大細胞β-氨基己糖苷酶釋放效率比較,其中pc3,pc9,pc10,pc17,pc27和pc28均能有效活化lad2肥大細胞(其β-氨基己糖苷酶釋放率均大于15%,且分別與陰性對照組比較,p0.05);同時,pc3,pc9,pc10,pc17,pc27和pc28對lad2肥大細胞的激活作用表現(xiàn)為劑量依賴性,pc17顯示出了較其它5種混合蛋白組分更優(yōu)的肥大細胞活化效力;6.pc17幽門螺桿菌混合蛋白組分和幽門螺桿菌尿素裂解液均能有效刺激lad2肥大細胞釋放β-氨基己糖苷酶、組胺以及tnf-α(分別和陰性對照組比較,p0.05),其釋放作用隨著刺激濃度的增加而增加;且由4μg/mlpc17引起的以上三種炎性介質(zhì)的釋放作用相當于150μg/ml幽門螺桿菌尿素裂解液所引起的;7.pc17和幽門螺桿菌尿素裂解液均能有效刺激lad2肥大細胞釋放il-3、ifn-γ和ltb4(分別與陰性對照組比較,p0.05),其釋放水平隨著時間增加而增加;同時,pc17混合蛋白組分引起肥大細胞釋放il-3、ifn-γ的作用優(yōu)于幽門螺桿菌尿素裂解液(組間比較,p0.05),引起釋放ltb4的作用和后者相當;幽門螺桿菌尿素裂解液及其pc17組分在監(jiān)測時間點內(nèi)均未觀測到能引起肥大細胞有效釋放il-4和il-17a(分別與陰性對照組比較,p0.05);8.液相色譜-質(zhì)譜分析以及數(shù)據(jù)庫比對顯示,幽門螺桿菌混合蛋白組分pc17主要由23種蛋白質(zhì)組成,其分子量范圍在21 k Da到35 kDa之間。結(jié)論1.幽門螺桿菌感染和CSU發(fā)病有密切相關(guān)性,提示幽門螺桿菌是CSU病程中的重要作用因素;2.在幽門螺桿菌相關(guān)的CSU患者中,體液免疫產(chǎn)生特異性抗體并不是主要的誘發(fā)或/和促進蕁麻疹發(fā)病因素;3.三種幽門螺桿菌全菌制劑,幽門螺桿菌尿素裂解液、幽門螺桿菌超聲粉碎上清和福爾馬林滅活的幽門螺桿菌,均能在體外有效活化人LAD2肥大細胞,這提示幽門螺桿菌很可能通過直接接觸激活而非通過抗體介導的通路激活肥大細胞,進而參與CSU病程;4.PC17混合蛋白組分是幽門螺桿菌全菌中最優(yōu)勢性的人肥大細胞活化成分,它能有效激活人LAD2肥大細胞釋放高水平的組胺、TNF-α、IL-3、IFN-γ和LTB4;5.PC17混合蛋白組分包含23種主要蛋白質(zhì)成分,其分子量范圍在21-35 kDa區(qū)間;6.PC17混合蛋白組分可被認為是參與與幽門螺桿菌感染相關(guān)的CSU發(fā)病機制的重要致病因子。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R758.24

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