發(fā)布時(shí)間：2017-10-23 14:11

  本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)shRNA沉默NCT基因的人永生化角質(zhì)細(xì)胞模型的構(gòu)建

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【摘要】：背景：反常性痤瘡(AI)又稱(chēng)化膿性汗腺炎,是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病。2010年,Wang等首先發(fā)現(xiàn)編碼γ-分泌酶不同亞單位的基因突變可引起家族性AI的發(fā)生。至今已報(bào)道在AI患者的γ-分泌酶不同亞單位的基因上存在超過(guò)20個(gè)不同的突變位點(diǎn),其中多數(shù)發(fā)生在NCT基因上,且均為功能缺失性突變。而NCT基因表達(dá)缺失在反常性痤瘡的發(fā)病機(jī)制中的作用還不明確,需要我們進(jìn)一步研究。目的：構(gòu)建NCT基因的RNA干擾慢病毒表達(dá)載體并在人永生化角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)上鑒定其沉默效率,進(jìn)而提供NCT基因穩(wěn)定下調(diào)的人永生化角質(zhì)細(xì)胞模型,為后續(xù)研究NCT基因下調(diào)對(duì)角質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)行為影響及其在反常性痤瘡的發(fā)病機(jī)制中的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：1.設(shè)計(jì)3個(gè)靶向NCT基因特異性的短發(fā)卡RNA (shRNA)表達(dá)序列并連接到慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pGLV3/H1/GFP+Puro中,成功構(gòu)建慢病毒重組表達(dá)質(zhì)粒,并通過(guò)測(cè)序鑒定。2.將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,產(chǎn)生慢病毒顆粒,并測(cè)其滴度。3.慢病毒感染HaCaT細(xì)胞,將細(xì)胞分為空白組(未感染病毒)、陰性對(duì)照組(NC組,感染空載病毒LV3-shNC)和干擾組(感染NCT-shRNA1、2、3慢病毒),流式細(xì)胞儀檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR檢測(cè)靶基因的沉默效率,并篩選出沉默效果最佳的干擾序列。結(jié)果：1.測(cè)序驗(yàn)證NCT-shRNA慢病毒重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.重組表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后生產(chǎn)的慢病毒顆粒滴度為109TU/ml。3.慢病毒感染HaCaT細(xì)胞后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率大于95%。與NC組相比,干擾組NCT mRNA表達(dá)量明顯下降,其中NCT-shRNA1組NCT基因沉默效果最佳,干擾效率達(dá)到75%。結(jié)論：1.成功地構(gòu)建了NCT-shRNA慢病毒重組表達(dá)載體。2.成功地篩選出高效NCT-shRNA干擾序列,并構(gòu)建了NCT基因穩(wěn)定下調(diào)的人永生化角質(zhì)細(xì)胞模型。
【關(guān)鍵詞】：反常性痤瘡 NCT基因 RNA干擾 慢病毒載體 HaCaT細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R758.74
【目錄】：

• 英文縮略語(yǔ)5-6
• 中文摘要6-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-10
• 第一部分 NCT基因的RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定10-22
• 材料與儀器10-11
• 實(shí)驗(yàn)方法11-16
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果16-22
• 第二部分 慢病毒載體介導(dǎo)的NCT基因沉默在HaCaT細(xì)胞中表達(dá)22-32
• 材料與儀器22-23
• 實(shí)驗(yàn)方法23-26
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-32
• 討論32-35
• 結(jié)論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-38
• 綜述38-46
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷46-48
• 致謝48-50

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 毛秋霞;慢病毒介導(dǎo)shRNA沉默NCT基因的人永生化角質(zhì)細(xì)胞模型的構(gòu)建[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

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本文編號(hào)：1083781