EphB4介導(dǎo)皮膚黑素瘤對順鉑耐藥的初步分子機制研究

發(fā)布時間：2017-10-17 18:46

本文關(guān)鍵詞：EphB4介導(dǎo)皮膚黑素瘤對順鉑耐藥的初步分子機制研究

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【摘要】：研究背景黑素瘤是惡性程度極高的一類腫瘤,其起源是神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞,占全部惡性腫瘤的1%-3%,常見于皮膚,和皮膚鱗癌、基底細(xì)胞癌一起是最主要的皮膚惡性腫瘤,其轉(zhuǎn)移發(fā)生時間早,且一旦發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移后,死亡率高達80%,近年來在我國發(fā)病率逐漸增加,每年新發(fā)病例約2萬例,且有明顯的家族聚集性。黑素瘤治療較為棘手,主要問題在于早期癥狀輕微,難以明確診斷并進行治療;常在原發(fā)病灶出現(xiàn)后不久即迅速發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移;黑素瘤對化療藥物不敏感,極易產(chǎn)生耐藥,使得對傳統(tǒng)化療藥物不起反應(yīng)而治療難度加大,目前看來以上原因已成為黑素瘤治療和預(yù)后的最大障礙。盡管目前包括靶向治療、免疫治療在內(nèi)的多種治療方法在黑素瘤治療中顯現(xiàn)出一定療效,但受限于臨床實際應(yīng)用,對于晚期已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的黑素瘤來說,以上方法治療效果都并不理想,這時人們往往將最后的希望寄托于細(xì)胞毒性即化療藥物上。在黑素瘤治療的“金標(biāo)準(zhǔn)”藥物達卡巴嗪廣泛應(yīng)用于臨床前,烷化劑類似物順鉑作為常規(guī)化療方案,單獨或聯(lián)合用于包括晚期黑素瘤的許多實體瘤患者的治療中,并顯現(xiàn)出一定療效。但令人遺憾的是,相比較于其它實體性腫瘤,晚期黑素瘤對順鉑反應(yīng)性較低,且很快發(fā)生耐藥,使得順鉑在黑素瘤應(yīng)用受到限制。長時間以來,人們投入大量精力進行順鉑耐藥機制研究,以求盡量延長順鉑在臨床使用時間以及擴大其使用范圍。目前看來,順鉑耐藥機制十分復(fù)雜,這其中包括細(xì)胞凋亡功能障礙、DNA損傷修復(fù)能力增強、重組活化、藥物吸收障礙、細(xì)胞膜功能狀態(tài)異常等,其中又以順鉑使用后細(xì)胞不能正常發(fā)生凋亡而在耐藥機制的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位。進一步深入黑素瘤對順鉑耐藥發(fā)生的機制研究,有利于人們重新掌握對晚期黑素瘤治療的主動能力,并擴大包括順鉑在內(nèi)其它相似化療藥物的臨床應(yīng)用范圍。本研究擬通過四部分進行,希望能夠從新角度來解釋黑素瘤對順鉑耐藥性發(fā)生的部分機制,進而對臨床治療黑素瘤患者產(chǎn)生積極影響。第一章對順鉑耐藥A375黑素瘤裸鼠移植模型的建立目的:建立對順鉑耐藥的A375黑素瘤裸鼠移植模型(以下簡稱Cis耐藥模型),為后續(xù)實驗及今后開展相關(guān)工作提供良好動物模型。方法:首先,復(fù)蘇培養(yǎng)具有較強侵襲力的人皮膚a375黑素瘤細(xì)胞,動物模型選定balb/c雌性裸鼠,按照4×106a375細(xì)胞數(shù)量/裸鼠進行接種,約30天后,待其成瘤,按照每組10只裸鼠,共10組進行實驗分組,給予順鉑2mg/kg、2次/周對成瘤裸鼠腹腔內(nèi)注射(ip),持續(xù)約40周,待實驗結(jié)束,觀察測量裸鼠體重百分比改變、黑素瘤體積和重量確認(rèn)cis耐藥模型是否建立成功。結(jié)果:常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)a375黑素瘤細(xì)胞成功后,進行裸鼠接種,接種后30天左右,可觀察到裸鼠荷瘤情況良好,移植瘤體積重量均達到實驗要求,裸鼠黑素瘤成瘤模型建立成功;隨后建立cis耐藥模型,發(fā)現(xiàn)實驗分組中第3、6組中有裸鼠獲得對順鉑耐藥性,表現(xiàn)為裸鼠對任何治療都耐受,形成黑素瘤體積重量明顯大于其它對順鉑敏感a375黑素瘤裸鼠模型(以下簡稱cis敏感模型),另外組間比較并未觀察到裸鼠狀態(tài)變差、體重明顯減輕以及急性、遲發(fā)毒性癥狀,表明cis耐藥模型建立成功。結(jié)論:成功建立了a375黑素瘤裸鼠成瘤模型,經(jīng)過順鉑長時間誘導(dǎo)后獲得cis耐藥模型,這為后續(xù)實驗及今后開展相關(guān)研究奠定良好的工作基礎(chǔ)。第二章ephb4誘導(dǎo)cis耐藥黑素瘤耐藥產(chǎn)生目的:制作基因芯片對cis敏感和耐藥裸鼠黑素瘤組織進行差異基因譜分析,找出表達差異基因,借此找到針對耐藥黑素瘤的新靶點藥物。方法:在前期成功獲得cis耐藥模型基礎(chǔ)上,我們成功分離cis敏感和耐藥黑素瘤腫瘤組織,提取rna,制作基因芯片,并進行差異基因譜分析,同時比較了常見的多個腫瘤活化相關(guān)基因,明確發(fā)現(xiàn)cis耐藥裸鼠黑素瘤組織高表達ephb4,之后采用ihc法和wb法進行確認(rèn);之后較大批量地建立cis耐藥模型,隨機分為pbs組、cis組、nvp-bhg712組和cis+nvp-bhg712組4組(每組10只),分別接受pbs液(ip,1次/日),2mg/kg順鉑(ip,2次/周),10mg/kgnvp-bhg712(ephb4特異性抑制劑,口服,1次/日)以及順鉑加nvp-bhg712聯(lián)合治療組持續(xù)給藥,待21天藥效實驗結(jié)束后觀察測量裸鼠體重百分比改變、黑素瘤體積重量,驗證以ephb4作為cis耐藥黑素瘤新作用靶點的真實性和可靠性。結(jié)果:通過對cis敏感和耐藥模型兩組黑素瘤組織進行差異基因譜分析,我們明確發(fā)現(xiàn)耐藥組中ephb4高表達,ihc法和wb法也驗證了實驗結(jié)果真實性。分組實驗表明,cis+nvp-bhg712能夠?qū)is耐藥黑素瘤產(chǎn)生明顯抑制作用。結(jié)論:cis耐藥黑素瘤高表達ephb4,聯(lián)合運用順鉑和nvp-bhg712后能夠?qū)is耐藥黑素瘤產(chǎn)生最大程度抑制作用。第三章ephb4誘導(dǎo)cis耐藥黑素瘤耐藥產(chǎn)生機制的初步研究目的:初步探討ephb4誘導(dǎo)cis耐藥黑素瘤耐藥性形成機制,比較重要細(xì)胞信號通路重關(guān)鍵分子變化,以及信號通路活化后對下游生物學(xué)功能如凋亡的影響,明確在cis耐藥黑素瘤中存在完整生物信號通路并對耐藥性形成產(chǎn)生關(guān)鍵作用;另外,單獨或者聯(lián)合使用順鉑、nvp-bhg712后觀察是否對以上信號通路活化產(chǎn)生影響;建立第2、3代對cis耐藥模型,并與第1代模型比較,了解cis耐藥黑素瘤獲得的耐藥性是否為穩(wěn)定表型。方法:wb法檢測cis敏感和耐藥黑素瘤中信號通路pi3k和mapk活化情況;使用順鉑和nvp-bhg712后,wb法檢測pi3k和mapk兩條信號通路被抑制的情況;通過tunel染色和annexinv/pi雙染色法檢測cis敏感和耐藥黑素瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生情況;最后我們建立了第2代和第3代cis耐藥模型,并分析了第1、2、3代耐藥模型中黑素瘤組織ephb4、pi3k和mapk的表達情況,證明建立的cis耐藥黑素瘤耐藥表型是穩(wěn)定的。結(jié)果:相比較cis敏感黑素瘤,cis耐藥黑素瘤表達更高水平p-akt和p-erk;使用cis+nvp-bhg712能夠?qū)-akt和p-erk活化產(chǎn)生最大程度抑制,另外單獨使用nvp-bhg712組中p-erk表達明顯減弱,ephb4表達在nvp-bhg712組中也出現(xiàn)減弱,說明耐藥基因組學(xué)的改變是因為順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的,而不是之前存在耐藥細(xì)胞亞群;tunel法和annexinv/pi法發(fā)現(xiàn)cis耐藥黑素瘤細(xì)胞凋亡力明顯下調(diào),單獨使用順鉑或nvp-bhg712都不能增強凋亡,而聯(lián)合使用順鉑和nvp-bhg712則引發(fā)凋亡增強;最后,我們建立了第2、3代耐藥模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)仍對順鉑耐藥,wb法發(fā)現(xiàn)第2、3代cis耐藥黑素瘤組織中ephb4、pi3k和mapk的表達與第1代相似,且黑素瘤生長能力進一步加強。結(jié)論:cis耐藥黑素瘤組織中p-akt和p-erk發(fā)生活化,使用cis+nvp-bhg712能夠最大限度地抑制此種活化,同時能夠增強黑素瘤細(xì)胞凋亡,此外,證實cis耐藥模型黑素瘤細(xì)胞獲得耐藥表型是穩(wěn)定的。第四章自噬在ephb4誘導(dǎo)cis耐藥黑素瘤耐藥發(fā)生中的作用目的:探討除了上述機制參與黑素瘤對順鉑耐藥性形成外,是否還有其它生物學(xué)機制參與耐藥性的形成,自噬作為細(xì)胞一項基本生理功能,是否與耐藥性形成相關(guān),值得我們關(guān)注。進一步探討自噬功能改變是否對cis耐藥黑素瘤細(xì)胞下游凋亡生物學(xué)功能產(chǎn)生影響,若有影響,是起促進作用還是抑制作用?這些問題的解答,將有助于我們更深入地了解cis耐藥黑素瘤耐藥性的形成并對臨床治療耐藥黑素瘤提供新思路。方法:MDC法觀察Cis敏感和耐藥黑素瘤組織自噬發(fā)生情況,WB法檢測兩組自噬蛋白表達情況;MDC法觀察PBS組、Cis組、NVP-BHG712組和Cis+NVP-BHG712組自噬形成情況;再次進行藥效實驗,將裸鼠分為PBS組、3-MA組和Cis+3-MA組(聯(lián)合使用Cis和3-MA),分別接受PBS液(IP,1次/日),15 mg/kg 3-MA(自噬特異性抑制劑,IP,1次/日)以及順鉑加3-MA聯(lián)合治療組持續(xù)給藥,待21天藥效實驗結(jié)束后觀察測量黑素瘤體積變化,以及各實驗組凋亡誘導(dǎo)發(fā)生和凋亡相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果:實驗發(fā)現(xiàn)與Cis敏感黑素瘤相比,耐藥黑素瘤自噬形成更強,自噬相關(guān)蛋白表達情況也更強;藥物干預(yù)后,Cis+NVP-BHG712組抑制自噬更強;而使用3-MA后,耐藥黑素瘤發(fā)生明顯抑制,當(dāng)與順鉑聯(lián)用時抑制更明顯,同時黑素瘤凋亡誘導(dǎo)及凋亡相關(guān)蛋白表達都更強烈。結(jié)論:自噬參與Cis耐藥黑素瘤耐藥性形成,且自噬水平同耐藥性成正相關(guān),使用Cis+3-MA能夠?qū)δ退幒谒亓霎a(chǎn)生最大程度抑制,也更容易誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞凋亡。全文結(jié)論1.成功建立了對順鉑耐藥A375黑素瘤裸鼠移植模型,且此耐藥為穩(wěn)定表型;2.Cis耐藥模型高表達EphB4,抑制EphB4功能后能夠?qū)is耐藥黑素瘤產(chǎn)生最大程度抑制,這為臨床治療耐藥黑素瘤患者提供新的作用靶點;3.EphB4活化引發(fā)下游PI3K和MAPK通路激活,并最終引起細(xì)胞自噬增強和凋亡功能障礙是EphB4誘導(dǎo)耐藥產(chǎn)生的重要機制,這為EphB4誘導(dǎo)黑素瘤對順鉑耐藥性提供重要理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：黑素瘤 順鉑耐藥 EphB4 PI3K/MAPK通路 自噬凋亡
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.5
【目錄】：