發(fā)布時間：2017-10-15 14:17

  本文關(guān)鍵詞：EPS-8沉默和過表達對黑色素瘤細胞A375生物學(xué)行為的影響

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【摘要】：背景和目的黑色素瘤(Melanoma)在整個世界范圍內(nèi)是最常見的皮膚、黏膜惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢,嚴重危害了人類健康。黑色素瘤的惡性程度較高,早期容易出現(xiàn)局部侵襲和遠處轉(zhuǎn)移,因此,對其早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是治療黑色素瘤的關(guān)鍵。然而,黑色素瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)分子機制仍然不十分明確,影響了對其早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療。研究與黑色素瘤發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因及其表達產(chǎn)物在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用,有助于闡明黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控的具體機制,同時也為黑色素瘤的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。表皮生長因子受體通路底物8(epidermal growth factor receptor pathway substrate 8,EPS-8)是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的激酶活性底物之一。EPS-8可作為一個多功能分子參與EGFR相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),并可在多種酪氨酸酶(包括受體型和非受體型)作用下,發(fā)生酪氨酸磷酸化。EPS-8廣泛分布于上皮細胞、間質(zhì)細胞以及造血細胞的細胞質(zhì)、細胞膜及核膜,其基因定位于染色體的12q23-q24。研究表明,EPS-8的表達及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與多種惡性腫瘤細胞增殖、凋亡和侵襲密切相關(guān)。然而,EPS-8在黑色素瘤中的表達及其在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機制仍不明確。本研究的第一章利用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)法,分析了EPS-8在正常皮膚組織和黑色素瘤組織中的表達;第二章構(gòu)建EPS-8沉默和過表達質(zhì)粒載體,運用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染成功率并利用RT-PCR和Western blot檢測EPS-8沉默和過表達質(zhì)粒對EPS-8的干擾效果;第三章運用CCK-8、克隆形成實驗、Hochest33258和侵襲實驗等檢測EPS-8對黑色素瘤細胞A375增殖、凋亡和侵襲能力的變化,旨在探討EPS-8在黑色素瘤中的表達及其在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機制,為EPS-8成為臨床診治黑色素瘤的靶點提供理論依據(jù)。方法1應(yīng)用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)S-P法檢測EPS-8在18例正常皮膚組織,62例黑色素瘤原發(fā)灶組織以及20例黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶組織中的表達,分析其與臨床病理資料之間的關(guān)系。2針對靶基因EPS-8的序列設(shè)計了4個sh RNA序列,構(gòu)建了4個干擾克隆EPS-8-SR1、EPS-8-SR2、EPS-8-SR3和EPS-8-SR4質(zhì)粒,利用GV248載體構(gòu)建重組sh RNA質(zhì)粒;將EPS-8序列插入GV144載體,構(gòu)建EPS-8過表達質(zhì)粒。干擾質(zhì)粒和過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5-α中,酶切和測序檢測后,運用Lipofectamine 2000試劑將構(gòu)建成功的目的基因EPS-8的干擾質(zhì)粒和過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入黑色素瘤A375細胞。應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測A375細胞中EPS-8基因和蛋白表達水平的變化,篩選出干擾作用最明顯的質(zhì)粒做后續(xù)研究。3將實驗細胞分為空白對照組(A375-control),陰性對照組(A375-NC),干擾組(A375-RNAi)和過表達組(A375-EPS-8),利用CCK-8和克隆形成實驗觀察EPS-8對A375細胞增殖能力的影響,Hochest 33258染色法檢測細胞凋亡情況,Western blot檢測相關(guān)蛋白表達水平改變,Transwell實驗檢測各組細胞的侵襲能力的變化。結(jié)果1 62例黑色素瘤原發(fā)灶組織中,EPS-8陽性表達38例,陽性表達率61.2%,20例黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶組織中EPS-8陽性表達17例,陽性表達率85.0%,18例正常皮膚組織中EPS-8陽性表達3例,陽性表達率16.7%。三者兩兩比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。黑色素瘤組織中EPS-8的陽性表達與腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05);而與年齡、性別無關(guān)(P0.05)。2熒光顯微鏡觀察EPS-8sh RNA序列干擾和過表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染黑色素瘤細胞A375,轉(zhuǎn)染率超過60%。轉(zhuǎn)染后A375細胞內(nèi)EPS-8基因和蛋白表達水平明顯改變。利用RT-PCR和Western blot檢測,EPS-8-SR3的干擾作用最明顯。3 CCK-8實驗結(jié)果顯示,A375-control組、A375-NC組、A375-RNAi組和A375-EPS-8組細胞的增殖率分別為65.31%±11.2%、61.29%±9.8%、28.74%±6.9%和85.67%±8.7%�？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示,A375-control組細胞和A375-NC組細胞的克隆形成數(shù)目分別為44±4.5和42±3.0,A375-RNAi組細胞的克隆形成數(shù)為34±2.7,A375-EPS-8組細胞的克隆形成數(shù)為58±3.6。Hochest33258檢測表明A375-RNAi組細胞凋亡率為42.3%±3.5%,A375-control組細胞凋亡率為19.1%±2.9%,A375-NC組細胞為18.8%±1.3%,而A375-EPS-8組細胞凋亡率為11.27%±3.5%。Western blot結(jié)果顯示,A375-RNAi組細胞中促凋亡蛋白Bax水平升高,抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低。Transwell侵襲試驗結(jié)果顯示,A375-control組、A375-NC組、A375-RNAi組和A375-EPS-8組細胞穿膜細胞數(shù)分別為21.50±3.62、23.20±4.13、13.70±2.85和39.80±5.45。結(jié)論1 EPS-8基因在黑色素瘤組織中過表達,且表達水平與黑色素瘤的TNM分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)。2 EPS-8干擾及過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑色素瘤A375細胞可明顯改變細胞內(nèi)EPS-8基因及蛋白表達水平。3 EPS-8基因過表達能促進黑色素瘤細胞A375增殖和侵襲,EPS-8基因沉默能促進黑色素瘤細胞A375凋亡,抑制A375細胞增殖和侵襲。EPS-8基因與黑色素瘤細胞A375增殖、凋亡和侵襲有關(guān),EPS-8基因沉默可能對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：黑色素瘤 表皮生長因子受體通路底物 8 增殖 侵襲
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 英文縮略詞表11-13
• 引言13-15
• 第一章 組織芯片檢測EPS-8 在黑色素瘤組織中的表達15-24
• 第二章 EPS-8 干擾和過表達質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選和鑒定24-45
• 第三章 EPS-8 對黑色素瘤細胞A375 增殖、凋亡和侵襲的影響45-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-60
• 綜述60-74
• 參考文獻70-74
• 個人簡歷74
• 研究生階段發(fā)表論文74-75
• 致謝75

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;中國黑色素瘤診治指南(2011版)[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2012年02期

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本文編號：1037581