本文關(guān)鍵詞：DEC1對成骨代謝的作用及機制研究

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【摘要】：骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis, OP)是一種以骨量減少和骨微觀結(jié)構(gòu)退化為特征,導(dǎo)致骨的脆性增加,以致于易發(fā)生骨折的一種全身性代謝性骨病。研究發(fā)現(xiàn),我國骨質(zhì)疏松癥患病率在6.6%-19.3%。中國已進入人口老齡化社會,隨著骨質(zhì)疏松患者增加、癥狀又有加重的趨勢,預(yù)計在未來骨折數(shù)量將日益增加,這對醫(yī)學、社會、經(jīng)濟各方面將帶來嚴重后果。因此對骨質(zhì)疏松癥的防治已成為世界性的重要衛(wèi)生問題。研究該疾病的發(fā)病原因、發(fā)病機制,研制新型的預(yù)防和治療藥物,選擇和建立適宜的動物和細胞模型對開展骨質(zhì)疏松病因研究有重要作用。1997年自人類軟骨細胞中分離得到的DEC1 (differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1),屬于生長發(fā)育基因。DEC1蛋白廣泛表達于多數(shù)正常組織,包括軟骨、肺、心臟、肝、脾、腎、腸。DEC1參與許多生理過程,如軟骨形成、神經(jīng)發(fā)生、免疫應(yīng)答、生物節(jié)律、脂質(zhì)形成、腫瘤的發(fā)生等。但是,DEC1在骨質(zhì)疏松疾病發(fā)展過程中扮演的角色如何,DEC1能否影響成骨細胞功能活性的改變,目前尚未見報道。本研究工作從整體和離體水平研究了DEC1對骨代謝的影響,并探討了DEC1可能的作用機制。本文的第一部分工作首先構(gòu)建了雙側(cè)卵巢切除和長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素兩種不同誘因引發(fā)的骨質(zhì)疏松模型小鼠。我們發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比,DEC1基因在兩種骨質(zhì)疏松造模小鼠骨髓腔中表達均有明顯下降。當我們進一步構(gòu)建DEC1基因敲除小鼠,對其四肢骨取樣檢測,發(fā)現(xiàn)與同齡野生小鼠相比,骨量存在明顯下降�；谝陨辖Y(jié)果提示的DEC1基因與骨骼發(fā)育存在的密切關(guān)系,我們開展了第二部分工作。我們建立了糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids, GCs)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松細胞模型,并以淫羊藿苷(Icariin, ICA)作為陽性對照藥物干預(yù),在此過程中我們發(fā)現(xiàn)了DEC1蛋白的高表達與成骨細胞分化活性增強存在著緊密聯(lián)系。另外,對SaoS-2細胞進行DEC1基因的過表達與敲除實驗進一步證實DEC1基因的成骨促進作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn),DEC1通過PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路實現(xiàn)對成骨細胞活性的調(diào)節(jié)。第一部分在體研究：DEC1在兩種不同小鼠骨質(zhì)琉松模型中的作用1,2及DEC1敲除鼠骨表型目的：隨著骨質(zhì)疏松患者增加、癥狀又有加重的趨勢,對骨質(zhì)疏松的防治已成為一個世界性的重要衛(wèi)生問題之一。有研究顯示DEC1與軟骨細胞發(fā)育分化過程關(guān)系密切,本部分探討DEC1在兩種骨質(zhì)疏松小鼠模型中的表達模式,以期拓寬DEC1在骨代謝研究領(lǐng)域的研究,揭示骨質(zhì)疏松疾病發(fā)生、發(fā)展的新途徑,為臨床上對骨質(zhì)疏松的治療提供新思路。方法：(1)構(gòu)建兩種不同的骨質(zhì)疏松小鼠模型：a.8周齡雌性小鼠雙側(cè)卵巢切除模擬女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis,PMOP);b.8周齡雄性小鼠皮下植入5mg,60d潑尼松龍(Prednisolone, PDL)緩釋片模擬糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥(Glucocorticoids induced osteoporosis, GCOP).不同模型(PMOP、GCOP)小鼠分別對應(yīng)給予小劑量雌二醇(Estradiol, E2)替代治療,和淫羊藿苷藥物干預(yù)治療。造模和干預(yù)結(jié)束后處死小鼠,提取小鼠四肢骨進行組織形態(tài)學,免疫學和顯微CT檢測。(2)制備DEC1基因敲除小鼠,檢測四肢骨骨量變化。結(jié)果：(1)與假手術(shù)組相比,不同方法制備的骨質(zhì)疏松模型小鼠骨髓腔中均存在DEC1蛋白表達量的減少(p0.05)。(2)治療組與骨質(zhì)疏松組相比較,DEC1蛋白表達量有所回升(p0.05)。(3) DEC1基因敲除小鼠與野生型小鼠相比,存在明顯的骨質(zhì)疏松樣表型(p0.05)。結(jié)論：小鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與DEC1表達量的減少有關(guān)。第二部分離體研究：DEC1激活PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路增加成骨細胞分化活性目的：本文第一部分實驗數(shù)據(jù)顯示,在整體動物模型上DEC1減少與骨量下降有直接關(guān)聯(lián)。第二部分內(nèi)容在細胞水平驗證糖皮質(zhì)激素對成骨活性的影響,并研究DEC1在此過程中扮演的角色,以期在分子水平闡明DEC1對成骨分化的作用機制。方法：(1)給予類SaoS-2類成骨細胞株大劑量地塞米松(Dexamethasone,DEX)藥物干預(yù),模擬成骨抑制的細胞模型。檢測該細胞模型下各種成骨表型標記物的變化以及DEC1蛋白水平的表達改變；對上述細胞模型給予淫羊藿苷藥物治療,檢測相關(guān)指標的變化。(2)檢測地塞米松干預(yù)下,SaoS-2細胞中的成骨關(guān)鍵信號β-catenin及其上游信號變化。(3)構(gòu)建高表達DEC1的SaoS-2細胞模型,檢測成骨表型及其相關(guān)成骨信號通路變化。(4)構(gòu)建低表達DEC1的SaoS-2細胞模型,檢測成骨表型及其相關(guān)成骨信號通路變化。結(jié)果：(1)地塞米松干擾SaoS-2細胞的分化過程,表現(xiàn)為堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)活性降低,染色減少、體外礦化結(jié)節(jié)形成減少、關(guān)鍵成骨蛋白Runt-related transcription factor 2 (Runx2)表達減少(p0.05)；同時DEC1蛋白表達降低,且糖皮質(zhì)激素的用量呈線性相關(guān)。(2)淫羊藿苷治療糾正了地塞米松組誘導(dǎo)的SaoS-2細胞的成骨活性的下降；并且回升DEC1的蛋白表達含量(p0.05)。(3)地塞米松抑制β-catenin的蛋白表達以及核轉(zhuǎn)位；DEC1在細胞核中的表達與β-catenin的表達模式存在正相關(guān)性(p0.05)。(4) DEC1過表達促進SaoS-2細胞的成骨分化過程；DEC1過表達同時促進β-catenin及其上游PIK3CA,Akt,GSK3β信號的激活(p0.05)。(5) DEC1敲除抑制SaoS-2細胞成骨表型的表達,并同抑制β-catenin及其上游信號的激活(p0.05)。結(jié)論：DEC1基因是參與成骨調(diào)節(jié)的重要因子,其作用可能通過激活PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信號通路而實現(xiàn)。
【關(guān)鍵詞】：骨質(zhì)疏松 DEC1 雌激素 糖皮質(zhì)激素 DEC1 成骨活性 β-catenin PIK3CA GSK3β
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R580
【目錄】：

• 中英文縮寫對照表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-19
• 第一部分 在體研究：DEC1在兩種不同小鼠骨質(zhì)疏松模型中的作用以及DEC1敲除鼠骨表型19-32
• 材料和方法20-24
• 結(jié)果24-29
• 討論29-32
• 第二部分 離體研究：DEC1激活PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路增加成骨細胞分化活性32-59
• 材料和方法33-44
• 結(jié)果44-56
• 討論56-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻60-68
• 綜述68-81
• 參考文獻75-81
• 碩士在讀期間發(fā)表的文章81-82
• 致謝82

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：944076