發(fā)布時間：2017-09-27 15:32

  本文關鍵詞：高脂血癥對小鼠拔牙創(chuàng)早期愈合過程的影響及其分子調控機制的初步研究

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【摘要】：目的全身系統(tǒng)狀況會影響拔牙創(chuàng)的愈合過程。研究表明,高脂血癥不僅是導致心血管疾病的高危因子,還可通過影響成骨細胞及破骨細胞的分化積極參與骨改建的進程。然而,目前關于高脂血癥微環(huán)境是否會影響拔牙創(chuàng)的愈合過程尚未見明確的研究報道。另外,雖然已有一些研究報道了高脂血癥抑制成骨細胞分化的分子生物學機制,仍有大片的未知領域等待進一步的探索。作為Wnt經(jīng)典信號通路特異性受體的競爭性抑制因子,分泌型卷曲相關蛋白1 (secreted frizzled-related protein 1, SFRP1)可通過調控Wnt信號經(jīng)典通路在骨代謝過程中起至關重要的調控作用。但目前尚不清楚高脂血癥對骨代謝的調控功能是否可通過調控SFRP1實現(xiàn)。為明確高脂血癥對拔牙創(chuàng)愈合過程的影響,并初步探索其分子生物學機制,本實驗擬選取C57BL/6小鼠和載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠),通過高脂飲食飼養(yǎng)建立高脂血癥小鼠模型,并在自然愈合的條件下,觀察高脂血癥對拔牙創(chuàng)愈合過程的影響。同時,構建編碼SFRP1基因3’非編碼區(qū)(untranslated regions, UTR)的熒光素酶表達載體,擬用于后續(xù)研究明確高脂血癥微環(huán)境下SFRP1對成骨細胞的分子調控是否受到影響。方法第一部分：選用6周齡雄性C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠,將小鼠隨機分為C57BL/6正常飲食組(WT+S), C57BL/6高脂飲食組(WT+HFD), ApoE-/-正常飲食組(ApoE+S)和ApoE-／-高脂飲食組(ApoE+HFD)四組。分別經(jīng)正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)4周后,經(jīng)內(nèi)眥取血檢測血脂水平。在喂養(yǎng)5周后,拔除小鼠雙側下領第2磨牙和第3磨牙。分別在拔牙后第1周和第2周處死小鼠,內(nèi)眥取血進行血脂水平檢測,并分離下頜骨進行HE染色和亞甲藍染色用于組織學測量,評價新骨形成量及牙槽嵴頂下降高度。第二部分：使用含50 mg/L抗壞血酸的成骨誘導液分別處理MC3T3-E1細胞0、7、10天。提取細胞總RNA,反轉錄成cDNA后,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,使用實時熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測細胞中SFRP1基因的mRNA表達水平。提取細胞蛋白質,以p-肌動蛋白(p-actin)為內(nèi)參,使用蛋白質印跡法(western blot, WB)檢測細胞中SFRP1蛋白的表達水平。使用PCR技術克隆SFRP1基因的YUTR區(qū)并連接到熒光素酶報告基因載體pMIR-REPORT上。所構建的新載體命名為pMIR-REPORT-SFRP1UTR.分別將pMIR-REPORT-SFRP 1 UTR和pMIR-REPORT轉染至MC3T3-E1細胞和NIH3T3細胞中,檢測細胞中熒光素酶的表達水平。結果第一部分：喂養(yǎng)4周后,血清學檢測結果顯示W(wǎng)T+HFD組血漿中總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-c)的濃度分別是WT+S組的2.2(p0.05)、1.87(p0.05)和1.54(正0.05)倍。而ApoE+HFD組血漿中TC、TG和LDL-c的濃度是ApoE+S組的2.06(p0.05)、3.51(p0.05)和2.52(p0.05)倍。拔牙后1周和2周時,血脂水平的檢測結果顯示出類似的變化。另外,拔牙后1周時WT+HFD組的新骨形成率低于WT+S組,且差別具有統(tǒng)計學意義(p0.05),而ApoE+HFD組新骨形成率雖然略低于ApoE+S組,但差別無統(tǒng)計學意義(p0.05)。拔牙后2周時,WT+HFD組的新骨形成率顯著低于WT+S組(p0.05),而ApoE+HFD組的新骨形成率也顯著低于ApoE+S組(p0.05)。通過測量牙槽嵴頂高度降低的程度,我們發(fā)現(xiàn)在拔牙后1周和2周時,WT+HFD組的舌側牙槽嵴頂降低程度均顯著大于WT+S組(p0.05),而ApoE+HFD組的舌側牙槽嵴頂降低程度也都大于ApoE+S組,且差別具有統(tǒng)計學意義(正0.05)。第二部分：成骨誘導0、7及10天后,細胞中SFRP1的mRNA水平分別為1.00±0.12、1.97±0.34和5.00±0.99,誘導10天與0天相比差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。成骨誘導0、7及10天后,細胞中SFRP1的蛋白水平分別為0.944±0.13、1.26±0.16及1.30±0.15, 誘導7、10天與0天相比差異均無統(tǒng)計學意義(p0.05)。MC3T3-E1細胞中,pMIR-REPORT轉染組和pMIR-REPORT-SFRP1UTR轉染組的熒光素酶表達量分別為487±34和744±10,二者差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。NIH3T3細胞中,pMIR-REPORT轉染組和pMIR-REPORT-SFRP1UTR轉染組的熒光素酶表達量分別為2707±117和2240±175,二者差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論第—部分：成功在C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠上建立了飲食干預的高脂血癥小鼠模型。高脂血癥抑制了小鼠拔牙創(chuàng)新骨的形成,延遲了骨愈合,同時促進了牙槽骨的吸收,加劇了拔牙后的骨喪失。第二部分： 成功構建了編碼SFRP1基因YUTR區(qū)的熒光素酶表達載體。SFRP1基因的YUTR區(qū)參與了SFRP1基因的轉錄后調控,且這種調控具有一定的細胞特異性。
【關鍵詞】：高脂血癥 拔牙創(chuàng) SFRP1 3'UTR Wnt信號
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R782.11;R589.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 中英文縮略詞對照表12-13
• 前言13-19
• 第一部分 高脂血癥對小鼠拔牙創(chuàng)早期骨愈合的影響19-32
• 材料和方法19-24
• 結果24-27
• 討論27-31
• 結論31-32
• 第二部分 小鼠成骨細胞中分泌型卷曲相關蛋白1轉錄后調控機制的研究32-46
• 材料和方法32-40
• 結果40-42
• 討論42-45
• 結論45-46
• 小結46-47
• 參考文獻47-55
• 致謝55-56
• 附錄56-57
• 學位論文評閱及況表57

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本文編號：930497