本文關鍵詞：人臍血干細胞移植對兔股動脈球囊損傷后內(nèi)膜修復和內(nèi)皮功能的影響

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【摘要】：目的:糖尿病周圍血管病變的病理改變?yōu)閯用}粥樣硬化,患者患病率高、發(fā)病年齡早、病情進展快,常伴多器官同時受累較多。內(nèi)皮細胞受損是糖尿病血管病變的始動因子之一,內(nèi)皮細胞分泌多種細胞因子,通過復雜的機制調(diào)節(jié)管壁的通透性及血管張力,血管的形成和重塑亦受內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)蛋白的影響。糖尿病下肢血管缺血性病變患者在應用動脈介入治療后,取得明顯療效,但是,由于介入治療引起的內(nèi)膜損傷也成為術后再狹窄的主要原因之一,如何預防介入治療后再狹窄成為亟待解決的問題。本研究旨在:1通過球囊擴張術制備兔后肢動脈內(nèi)膜損傷模型,損傷動脈內(nèi)膜局部行人臍血干細胞移植。2通過監(jiān)測移植前后血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、內(nèi)皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)水平的變化,觀察人臍血干細胞(HUCBSC)移植對內(nèi)皮功能的影響。3通過損傷動脈內(nèi)膜病理變化觀察人臍血干細胞移植對動脈內(nèi)膜的修復作用,探討臍血干細胞移植對介入治療后再狹窄的預防作用。方法:實驗對象新西蘭大白兔18只,由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院實驗動物中心提供,為清潔級,雄性,體重2.1±0.5Kg。隨機分為三組,每組6只,正常對照組(A組),只行兔左側股動脈分離術;球囊損傷組(B組),單純行左側股動脈球囊擴張、牽拉,造成動脈內(nèi)膜損傷;球囊損傷后人臍血干細胞移植組(C組),于球囊損傷左側股動脈后行人臍血干細胞移植,同時A組和B組注射等量的PBS緩沖液作為對照,術畢均予縫合傷口,青霉素鈉(160萬U/次,2次/日)肌肉注射抗感染,連用3d,肝素鈉注射液(200U/Kg.d)連用3d。各組動物于術前及干預后1周、4周采集外周血,用ELISA法測定VEGF的水平、ET-1的水平,血漿NO采用硝酸還原酶法測定;術后4周所有動物處死前取左側股動脈,行HE染色觀察內(nèi)膜修復情況。1人臍血干細胞(HUCBSC)的采集、分離、制備人臍血來源于足月分娩健康產(chǎn)婦,采集新鮮臍血(6h內(nèi)用完),先用PBS液等倍數(shù)稀釋后放置于離心管(50ml)中,按1:1配比加入至人淋巴細胞分離液上,4℃保存,8cm離心半徑,每分鐘2000轉,離心20分鐘后,臍血分成5層,單個核細胞在中間白膜層,此時用移液器在中間白膜層小心吸取含單個核細胞的混懸液,放入另一個離心管中,4℃,8cm離心半徑,每分鐘1000轉,離心15分鐘,PBS液洗滌3次。最后用低糖DMEM培養(yǎng)液懸浮,細胞濃度計數(shù)為5×105/ml.人臍血干細胞混懸液采集、分離、制備成功。2兔股動脈球囊損傷模型制備從兔耳緣靜脈注入3%戊巴比妥鈉2ml/kg麻醉,術中肝素200u/kg抗凝,于左側腹股溝韌帶至膝關節(jié)上下縱行切開,分離左側股動脈,夾閉近端、遠端血管,于近心端進行股動脈穿刺,A組:僅行左側后肢股動脈分離術;B組、C組行股動脈穿刺后把3.0-40mm球囊緩慢送入至股動脈,給12個大氣壓充盈球囊,保持3分鐘,間歇1分鐘后重復上述操作,共操作3次,同時牽拉球囊,以制成兔左后肢股動脈球囊損傷模型。3球囊損傷后人臍血干細胞移植術B、C兩組球囊損傷兔左后肢股動脈模型制備成功后,恢復股動脈血流3分鐘,夾閉A、B、C三組分離的股動脈遠端,A、B組于夾閉股動脈近端處注入0.5ml PBS緩沖液,C組在夾閉股動脈近端處注入已制備好的人臍血干細胞混懸液0.5ml。注射完畢后,三組分離的股動脈近端均用血管夾夾閉30分鐘,讓移植的干細胞充分歸巢,手術縫合傷口,使股動脈恢復血流。肝素(200U/kg.d),抗凝3天。4移植前后血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、內(nèi)皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)水平的測定A、B、C三組術前、術后1周、術后4周均采外周血5ml,枸櫞酸鈉抗凝,分離血漿備用。VEGF、ET-1測定采用ELISA法,單位:μg/L。血漿一氧化氮(NO)測定采用硝酸還原酶法測定,單位:umol/L。5損傷血管內(nèi)膜修復的觀察移植后4周,常規(guī)方法制備兔損傷血管光鏡組織切片,行蘇木素-伊紅(HE)染色,采集圖像,觀察損傷血管內(nèi)膜修復情況。應用SPSS14.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,計量資料以(?)±s表示,組間、組內(nèi)比較采用方差分析(F檢驗),以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果:1實驗動物觀察A、B、C三組動物術后傷口逐漸愈合,無糜爛潰瘍,活動能力正常,所有動物在處死取材時,局部均無壞疽,所有動物中途無因故退出。2 VEGF水平測定結果術前,A、B、C三組VEGF水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);術后1周,C組VEGF水平升高,高于B組和A組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),B組VEGF水平高于A組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);術后4周,C組VEGF水平仍高于B組和A組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),B組VEGF水平高于A組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。A組組內(nèi)VEGF水平術前、術后1周、術后4周差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);B組組內(nèi)VEGF水平術后4周高于術前、術后1周,術后1周高于術前,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);C組組內(nèi)VEGF水平術后1周高于術前、術后4周,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),術后4周高于術前,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3 ET-1和血漿NO水平的變化A、B、C三組術前ET-1水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);術后1周,C組ET-1水平低于A、B兩組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),B組ET-1水平低于A組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);術后4周C組ET-1水平均低于于A、B兩組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),B組ET-1水平低于A組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。A組組內(nèi)ET-1水平術前、術后1周、術后4周差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);B組組內(nèi)ET-1水平術前、術后1周、術后4周兩兩比較均有差異(P0.05);C組組內(nèi)ET-1水平術前與術后4周無差異,術后4周低于術后1周,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。A、B、C三組術前NO水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);術后1周,C組NO水平高于A、B兩組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),A、B兩組NO水平差異不顯著;術后4周,C組NO水平高于A、B兩組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),A、B兩組NO水平差異不顯著。C組術后4周較術前、術后1周均有升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。A組組內(nèi)NO水平術前、術后1周、術后4周差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);B組組內(nèi)NO水平術前高于術后1周、術后4周,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),術后1周NO水平高于術后4周,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);C組組內(nèi)NO水平術后4周較術前、術后1周均有升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),術前高于術后1周,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4股動脈內(nèi)膜修復的觀察術后4周,C組動物股動脈有輕度內(nèi)膜中斷和增生,彈力膜輕度斷裂,B組動物股動脈內(nèi)膜連續(xù)性中斷,內(nèi)膜增生明顯,彈力膜斷裂明顯;A組動物股動脈內(nèi)膜完整,彈力膜連續(xù),無斷裂。結論:1本實驗通過球囊擴張并阻斷血流建立兔左后肢股動脈缺血損傷模型。2人臍血干細胞移植可能促進兔模型血清VEGF分泌,誘導血管形成,增強內(nèi)皮細胞的修復能力。3人臍血干細胞移植后有助于兔模型血清NO的升高,ET-1水平降低,從而減輕血管收縮程度,促進兔受損動脈內(nèi)膜的再內(nèi)皮化,改善內(nèi)皮功能,預防血管再狹窄的發(fā)生。4人臍血干細胞移植可能修復兔受損血管內(nèi)膜。
【關鍵詞】：人臍血干細胞 血管內(nèi)皮細胞生長因子 一氧化氮 內(nèi)皮素-1 內(nèi)膜修復
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-14
• 英文縮寫14-15
• 前言15-16
• 材料與方法16-21
• 結果21-23
• 附圖23-26
• 附表26-28
• 討論28-32
• 結論32-33
• 參考文獻33-37
• 綜述 干細胞移植與糖尿病及并發(fā)癥防治的研究進展37-48
• 參考文獻44-48
• 致謝48-49
• 個人簡歷49

【參考文獻】

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本文編號：841452