發(fā)布時間：2017-08-17 17:19

  本文關鍵詞：SAA通過誘導中性粒細胞形成NETs參與RA炎癥機制的研究

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【摘要】：目的中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps,NETs),是由中性粒細胞在適當的刺激下形成的由染色質及粘附其上的顆粒蛋白構成的網狀結構。NETs形成后能夠發(fā)揮免疫防御的功能,此外,它參與了多種病理過程。在多種自身免疫病的患者體內發(fā)現NETs形成異常,并且在多個方面影響了病程進展。血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A,SAA),作為急性時相蛋白的一種,是炎癥反應的重要參與者。本研究組之前研究發(fā)現在類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者的血清和滑膜組織中SAA表達量升高,并與RA的疾病活動程度呈正相關關系。SAA可作用于中性粒細胞能夠引起多種效應,但其是否與NETs的形成有關尚未有研究報道。SAA作用于中性粒細胞能夠誘導中性粒細胞生成活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)。而ROS的形成是NETs形成過程中的關鍵步驟,且有報道ROS能夠直接誘導中性粒細胞形成NETs,推測SAA可誘導NETs形成。目前有關NETs在RA中的研究剛起步,相關文獻只有零星報道,并存在矛盾之處。本研究的主要目的是探究RA患者體內NETs的形成,及其是否受SAA的誘導以及NETs在RA炎癥反應中的作用。方法1.ELISA的方法檢測血清中的MPO、NE含量,熒光染色方法相對定量地檢測RA患者與健康對照血清中的細胞外DNA含量。2.免疫熒光法檢測并觀察RA和OA患者滑膜組織中的NETs。3.Pearson線性相關分析RA血清中NETs(MPO)含量與RA疾病活動度(相關指標:ESR、CRP和DAS28)的相關性。4.Pearson線性相關分析RA血清中NETs(MPO)含量與血清中相應抗體含量(anti-CCP、RFIg G、RFIg A)的相關性。5.MTT實驗分析NETs對體外培養(yǎng)的RAFLS和HUVECs增殖的影響。6.密度梯度離心法分離健康志愿者外周血中的中性粒細胞,分離后臺盼藍染色鑒定細胞活力,HE染色分析細胞純度。7.將分離獲得的中性粒細胞體外培養(yǎng),并分為SAA組、LPS組和陰性對照組,分別加入SAA、LPS和tris-HCL緩沖液作為刺激劑,誘導NETs的形成。熒光染色法觀察上述培養(yǎng)細胞形成NETs細胞的百分率。8.ELISA的方法定量檢測上述培養(yǎng)細胞上清中的h3含量。結果1.RA組的MPO水平(4.257±0.4840 mg/L),NE水平(1.992±0.07389 mg/L),均顯著高于健康對照組:MPO(1.054±0.1130 mg/L),NE(1.707±0.06374mg/L)(P0.05)。RA組的DNA含量(17.51±1.319 RFU)顯著低于健康對照組(22.68±0.9035 RFU)(P0.05)。2.免疫熒光結果顯示,相對于OA患者,RA滑膜組織中觀察到更多的NETs。3.pearson線性相關分析結果顯示,RA患者血清中的MPO水平與ESR(R2=0.365,P0.05)和DAS28(R2=0.288,P0.05)呈正相關,而與血清中的CRP(R2=0.0256,P0.05)含量無相關關系。4.Pearson線性相關分析結果顯示,RA患者血清中的MPO水平與血清中抗體含量(anti-CCP、RFIg G、RFIg A)無相關關系。5.NETs能夠促進體外培養(yǎng)的FLS與HUVECs的增殖。6.HE染色鑒定分離的細胞中,中性粒細胞純度在95%以上,臺盼藍染色鑒定分離的中性粒細胞活力在95%以上。7.形成NETs的細胞占總細胞的百分率,SAA組顯著高于陰性對照(Tris-HCL緩沖液,NC組)組(SAA:0.168±0.008;NC:0.039±0.006;F=46.08,P0.05,n=12)。8.細胞培養(yǎng)液上清中h3的含量SAA組也顯著高于陰性對照組(SAA:34.24±0.57;NC:24.03±0.74;F=56.25,P0.05,n=12)。結論1.RA患者血清中的MPO含量和NE含量顯著高于健康對照組,提示RA患者血清中可能有NETs形成的增高。免疫熒光結果顯示RA滑膜組織中NETs的形成顯著高于OA,說明RA滑膜組織中NETs形成增多。以上結果提示至少在RA滑膜組織局部NETs形成增多。2.MPO含量與DAS28、ESR呈正相關關系,提示MPO與RA炎癥反應有關。RA患者滑膜中NETs形成增多,且NETs能夠促進體外培養(yǎng)的FLS和HUVECs增殖,提示中性粒細胞或通過形成NETs直接促進RA的滑膜增生和血管翳形成,參與RA滑膜炎癥。3.SAA組與LPS組形成NETs的細胞百分率和細胞培養(yǎng)液上清中的h3水平顯著高于陰性對照組,提示SAA能夠在體外誘導中性粒細胞形成NETs。
【關鍵詞】：中性粒細胞胞外誘捕網 類風濕關節(jié)炎 血清淀粉樣蛋白A 髓過氧化物酶 疾病活動度 滑膜增生
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R593.22
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-14
• 前言14-22
• 研究現狀、成果14-21
• 研究目的、方法21-22
• 一、NETs參與RA炎癥反應的研究22-41
• 1.1 對象和方法22-34
• 1.1.1 研究對象22-23
• 1.1.2 試劑與儀器23
• 1.1.3 實驗方法23-34
• 1.1.4 統(tǒng)計學方法34
• 1.2 結果34-38
• 1.2.1 RA患者血清中的MPO、NE水平升高，DNA水平降低34-35
• 1.2.2 RA滑膜中有NETs形成35-36
• 1.2.3 血清中的MPO水平與RA的疾病活動度相關36-37
• 1.2.4 NETs促進FLS與HUVECs的增殖37-38
• 1.3 討論38-40
• 1.4 小結40-41
• 二、血清淀粉樣蛋白A誘導中性粒細胞形成NETs41-52
• 2.1 對象和方法41-46
• 2.1.1 研究對象41
• 2.1.2 試劑與儀器41-42
• 2.1.3 實驗方法42-46
• 2.1.4 統(tǒng)計學方法46
• 2.2 結果46-50
• 2.2.1 中性粒細胞的提取46-47
• 2.2.2 SAA誘導中性粒細胞形成NETs47-49
• 2.2.3 SAA誘導的中性粒細胞培養(yǎng)液中的h3含量升高49-50
• 2.3 討論50-51
• 2.4 小結51-52
• 結論52-53
• 參考文獻53-60
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明60-61
• 綜述 中性粒細胞胞外誘捕網與自身免疫病61-70
• 綜述參考文獻66-70
• 致謝70-71
• 個人簡歷71

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本文編號：690202