本文關鍵詞：DNA去甲基化增強人牙周膜干細胞成骨能力并逆轉其在高糖環(huán)境下受損的成骨潛能

  更多相關文章： 高糖 DNA甲基化 人牙周膜干細胞 經典Wnt信號通路 成骨向分化

【摘要】：第一部分I型糖尿病大鼠模型的構建及其牙周膜甲基化水平檢測目的:建立I型糖尿病大鼠模型,檢測其牙槽骨骨量變化及牙周膜中DNA甲基化程度。方法:30只8周齡雄性SD大鼠,隨機分為兩組分別注射鏈脲佐霉素(Streptozotocin,STZ,60mg/kg)和檸檬酸鈉(1 m L/kg)。成功建立糖尿病大鼠模型后,分別選取兩組中大鼠下頜骨及磨牙、牙周膜等周圍鄰近組織行micro CT檢測骨量變化。同時運用免疫組化手段檢測糖尿病大鼠牙周膜中5甲基胞嘧啶(5-m C)含量以表征其甲基化程度。結果:糖尿病大鼠與對照組大鼠相比牙槽骨骨量明顯減少,并且牙周膜中5-m C含量明顯增加。結論:I型糖尿病大鼠模型表現(xiàn)出牙槽骨減少及牙周膜甲基化程度增高的臨床表征。第二部分體外人牙周膜干細胞的獲得和鑒定目的:分離及培養(yǎng)人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells,h PDLSCs),檢測其多向分化能力和間充質細胞表征。方法:采用12位年齡在14-18周歲臨床接受正畸拔牙矯治患者所拔除健康前磨牙,刮取牙周膜組織并采用組織塊酶消化法以獲得目的細胞。檢測其多向分化能力;通過免疫熒光細胞化學染色檢測細胞角蛋白(CK14)和波形絲蛋白(Vimentin)以驗證其間充質細胞特性;通過流式細胞術(FCM)檢測間充質細胞表面抗原以排除造血細胞、單核細胞等混入對試驗結果造成影響。結果:獲得的h PDLSCs能成功誘導出礦化結節(jié)、脂滴及神經細胞樣突起;Vimentin染色陽性,CK14染色陰性;流式檢測沒有出現(xiàn)造血或單核等其他來源的細胞。結論:經鑒定,分離出的目的細胞具有多向分化能力并為間充質來源的干細胞。第三部分DNA甲基化抑制劑5-aza-d C在高糖環(huán)境下對h PDLSCs甲基化程度及成骨分化能力的影響目的:明確甲基化抑制劑在高糖環(huán)境下對h PDLSCs甲基化程度及成骨向分化能力的影響。方法:通過向培養(yǎng)液中加入葡萄糖(30m M)、DNA甲基化抑制劑5-aza-d C(1μM),將人牙周膜干細胞隨機分為四組:高糖組、抑制劑組、高糖加抑制劑組及對照組。在成骨誘導液中分別培養(yǎng)4天后運用實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應實驗(Real-time RT-PCR)檢測高糖組和對照組甲基化相關基因(Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b)變化,并分別于3天和7天提取四組DNA行整體甲基化水平檢測。檢測四組細胞在成骨誘導液中培養(yǎng)3天及7天時堿性磷酸酶(ALP)活性,茜素紅染色檢驗四組細胞體外培養(yǎng)2周后礦化結節(jié)形成狀況,提取四組細胞3天和7天時的m RNA和總蛋白,RT-PCR檢測成骨分化相關標志基因(ALP、OCN、OPN和OSX)的表達情況,蛋白免疫印跡實驗(Western blot)檢測骨向分化相關蛋白(ALP、OPN和OSX)的表達情況。結果:高糖組Dnmts的表達及DNA整體甲基化程度較對照組明顯升高,抑制劑組降低DNA甲基化程度的同時能降低高糖環(huán)境下升高的甲基化程度;在成骨誘導條件下,抑制劑組相較于其他三組在ALP活性、礦化結節(jié)形成量、成骨向分化標志基因及蛋白表達(ALP、OCN/OCN、OPN/OPN、OSX/OSX)均明顯增高,高糖和抑制劑組檢測指標次之,高糖組檢測指標均最低。結論:在高糖環(huán)境中,h PDLSCs的甲基化程度升高并伴隨著成骨向分化能力的減弱,DNA甲基化抑制劑5-aza-d C能逆轉高糖環(huán)境下被削弱的成骨潛能。第四部分5-aza-d C通過經典Wnt信號通路逆轉h PDLSCs在高糖環(huán)境下受損的成骨能力目的:探討經典Wnt信號通路參與高糖環(huán)境下5-aza-d C調控h PDLSCs成骨分化過程中的機制。方法:Western blot分別于3天和7天檢測高糖組、抑制劑組、高糖加抑制劑組和對照組中經典Wnt信號通路中胞內信號分子β-catenin(non-p active)和p-GSK-3β以及細胞核轉錄因Lef1表達量;加入經典Wnt通路胞外抑制劑DKK1(100ng/ml),采用Western blot分別于1天和3天檢測抑制劑組、DKK1組、高糖組、抑制劑加DKK1組、高糖加抑制劑組、高糖加DKK1組以及高糖加抑制劑及DKK1共處理組成骨向分化標志蛋白(ALP、OPN和OSX)的表達情況。結果:高糖組中經典Wnt信號通路相關因子水平表達降低,抑制劑組中相關因子表達升高并可逆轉高糖對經典Wnt信號通路的抑制作用,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);加入DKK1后,h PDLSCs成骨向分化標志蛋白表達量降低,DKK1加抑制劑組以及高糖和抑制劑及DKK1組成骨向分化標志蛋白表達量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:5-aza-d C通過經典Wnt信號通路逆轉h PDLSCs在高糖環(huán)境下受損的成骨能力。
【關鍵詞】：高糖 DNA甲基化 人牙周膜干細胞 經典Wnt信號通路 成骨向分化
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1;R781
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-14
• 前言14-15
• 第一部分 Ⅰ型糖尿病大鼠模型的構建及其牙周膜甲基化水平檢測15-23
• 1 材料和方法16-18
• 2 結果18-20
• 3 討論20-22
• 結論22-23
• 第二部分 人牙周膜干細胞的獲得和鑒定23-30
• 1 材料和方法23-27
• 2 結果27-29
• 3 討論29-30
• 結論30
• 第三部分 DNA甲基化抑制劑 5-aza-d C在高糖環(huán)境下對h PDLSCs甲基化程度及成骨分化能力的影響30-42
• 1 材料和方法31-37
• 2 結果37-40
• 3 討論40-42
• 結論42
• 第四部分 5-aza-d C通過經典Wnt信號通路逆轉h PDLSCs在高糖環(huán)境下受損的成骨能力42-49
• 1 材料和方法43-44
• 2 結果44-47
• 3 討論47-48
• 結論48-49
• 參考文獻49-59
• 英漢縮略詞對照表59-60
• 致謝60-62
• DNA甲基化對干細胞多向分化的調控及其機制(綜述)62-75
• 參考文獻69-75
• 附件75-77

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1 毛釗;影響牙周膜細胞生物學功能的相關因素[J];醫(yī)學研究生學報;2003年06期

2 凌均h，

本文編號：689954