本文關(guān)鍵詞：高濃度胰島素對(duì)腎小管上皮細(xì)胞白蛋白、葡萄糖重吸收的影響

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【摘要】：目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)為糖尿病特征性微血管并發(fā)癥之一,但其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,且2型糖尿病腎病病理表現(xiàn)差異很大。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其早期病變主要累及腎小球,并將微量白蛋白尿(microalbuminuria,MAU)作為早期臨床診斷指標(biāo),但越來(lái)越多的研究顯示糖尿病腎病在腎小球出現(xiàn)明顯損傷之前已存在腎小管及間質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能損傷,臨床主要表現(xiàn)為腎小管性蛋白尿及酶尿,甚至有研究在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中觀察到早期白蛋白尿源于腎小管損傷導(dǎo)致的重吸收功能受損,而非源自腎小球。此外,腎小管間質(zhì)損傷與慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)導(dǎo)致的腎小球?yàn)V過(guò)率(glomerular filtration rate,GFR)下降及腎功能惡化的關(guān)系更加密切。因此,腎小管損傷在糖尿病腎病中的發(fā)生原因、機(jī)制及其結(jié)構(gòu)功能改變應(yīng)受到重視。我們前期研究發(fā)現(xiàn),78.2%的DM患者在尿微量白蛋白升高前,已出現(xiàn)不同程度的腎小管功能異常,以高脂飼料喂養(yǎng)OLETF大鼠誘導(dǎo)的2型糖尿病模型,在糖耐量減低期(impaired glucose tolerance,IGT)即已出現(xiàn)明顯的腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)微血管的病理?yè)p傷,且尿中反映腎小管損傷的指標(biāo):尿視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)等排泄增加,但腎小球的結(jié)構(gòu)及反映其功能的血液、尿液生化指標(biāo)未見(jiàn)明顯異常。那么在糖尿病前期,導(dǎo)致腎小管結(jié)構(gòu)及功能損傷的原因是什么?胰島素抵抗/高胰島素血癥是CKD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有研究發(fā)現(xiàn)高胰島素對(duì)腎臟的損害在血糖升高前即已開(kāi)始。IGT期一個(gè)重要的病理生理變化就是胰島素抵抗(insulin resistance,IR)及在此基礎(chǔ)上逐漸出現(xiàn)的代償性高胰島素血癥。這種代償升高的胰島素雖然有助于控制血糖,但過(guò)高的胰島素對(duì)腎臟等其它組織卻是有害的。那么在血糖尚未明顯升高之前,以胰島素抵抗/高胰島素血癥為主要特征的代謝紊亂是否會(huì)影響腎小管的結(jié)構(gòu)及功能,參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展?腎臟在體內(nèi)糖代謝過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。所有的腎小球細(xì)胞和腎小管細(xì)胞均存在胰島素受體。腎臟正常的胰島素信號(hào)通路依賴(lài)胰島素與其細(xì)胞膜受體的結(jié)合,并激活一系列細(xì)胞內(nèi)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮效應(yīng)。因此我們推測(cè),高濃度胰島素可能通過(guò)胰島素信號(hào)通路影響腎小管功能。本研究以大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E)為研究對(duì)象,觀察在不同胰島素濃度及不同干預(yù)時(shí)間作用下,腎小管上皮細(xì)胞對(duì)白蛋白及葡萄糖重吸收的變化,以及介導(dǎo)白蛋白(megalin,cubilin)及葡萄糖(SGLT2,GLUT2,SGLT1,GLUT1)重吸收的受體表達(dá)的變化,同時(shí)探討INS/IRS-1/PI3K/Akt通路在其中的參與作用。方法:1.MTT法檢測(cè)不同濃度的胰島素對(duì)NRK-52E細(xì)胞活力的影響,并結(jié)合胰島素的生理濃度以確定其干預(yù)濃度,并進(jìn)一步分為對(duì)照組、胰島素低濃度組、中等濃度組及高濃度組。2.不同濃度的胰島素作用于NRK-52E細(xì)胞24h后,運(yùn)用免疫熒光法、熒光定量PCR(Fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)和蛋白免疫印跡(Western Blot,WB)技術(shù)分別從基因和蛋白水平檢測(cè)megalin,cubilin,SGLT2,GLUT2,SGLT1及GLUT1受體表達(dá)量的變化。3.以高濃度胰島素干預(yù)細(xì)胞不同時(shí)間(0,1h,6h,12h,24h,48h)后,分別用免疫熒光、熒光定量PCR和Western Blot法檢測(cè)megalin,cubilin,SGLT2,GLUT2,SGLT1及GLUT1受體表達(dá)量的變化。4.應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察NRK-52E細(xì)胞吞飲異硫氰酸四甲基羅丹明標(biāo)記的牛血清白蛋白(TRITC-albumin)的變化。5.應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察NRK-52E細(xì)胞吞飲熒光標(biāo)記2-脫氧葡萄糖(2-NDBG)的變化。6.應(yīng)用FQ-PCR和Western Blot法檢測(cè)在不同濃度的胰島素及不同干預(yù)時(shí)間作用下,NRK-52E細(xì)胞IRS-1、PI3K及Akt的變化。7.設(shè)置對(duì)照組、PI3K抑制劑組與高濃度胰島素干預(yù)組,應(yīng)用免疫熒光法觀察各組對(duì)TRITC-albumin、2-NDBG的重吸收及各受體蛋白的變化趨勢(shì)并進(jìn)行比較。結(jié)果:1.結(jié)合MTT法檢測(cè)結(jié)果,確定胰島素干預(yù)濃度:0 ng/ml(對(duì)照組),5 ng/ml(低濃度干預(yù)組,相當(dāng)于生理濃度),10 ng/ml(中等濃度干預(yù)組),50ng/ml(高濃度干預(yù)組)。2.不同胰島素濃度干預(yù)下,NRK-52E細(xì)胞的megalin與cubilin表達(dá)量均在低濃度干預(yù)組最大(P0.05),以后逐漸減少,至高濃度干預(yù)組表達(dá)最少。二者在干預(yù)時(shí)間為0-6h逐漸增加,至6h最大(P0.05),此后逐漸減少,至48h最少。3.NRK-52E細(xì)胞對(duì)白蛋白的攝取與胰島素濃度有關(guān),在胰島素干預(yù)濃度為5ng/ml時(shí)最大(P0.05),此后隨干預(yù)濃度的增加,攝取量逐漸減少。4.不同胰島素濃度干預(yù)下,NRK-52E細(xì)胞SGLT2與GLUT2的表達(dá)呈濃度依賴(lài)性增加,GLUT1僅在高濃度胰島素干預(yù)組表達(dá)量增加,SGLT1未見(jiàn)明顯變化。不同干預(yù)時(shí)間條件下,各葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的最高表達(dá)量均出現(xiàn)在干預(yù)6h(P0.05),此后雖有減少,但仍較對(duì)照組高。5.NRK-52E細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吞飲量隨胰島素濃度的增加而增加。6.高濃度胰島素條件下,腎小管上皮細(xì)胞的胰島素信號(hào)通路IRS-1、PI3-K及Akt的活性受到抑制(P0.05)。結(jié)論:1.高濃度胰島素條件下,腎小管上皮細(xì)胞胰島素信號(hào)通路IRS-1/PI3-K/Akt受到抑制。2.高濃度胰島素通過(guò)抑制信號(hào)通路IRS-1/PI3-K/Akt,下調(diào)白蛋白內(nèi)吞受體megalin、cubilin的表達(dá),導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞對(duì)白蛋白的重吸收障礙。3.胰島素對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響各不相同,高濃度胰島素可通過(guò)上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體SGLT2、GLUT2的表達(dá)而促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。4.高濃度胰島素對(duì)腎小管上皮細(xì)胞葡萄糖重吸收的調(diào)控并非通過(guò)胰島素信號(hào)通路IRS-1/PI3-K/Akt,其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：高濃度胰島素 腎小管 megalin cubilin 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明13-14
• 前言14-17
• 研究現(xiàn)狀、成果14-15
• 研究目的、方法15-17
• 技術(shù)路線117-18
• 技術(shù)路線218-19
• 一、高濃度胰島素對(duì)NRK-52E細(xì)胞白蛋白重吸收的影響19-41
• 1.1 對(duì)象和方法19-21
• 1.1.1 研究對(duì)象19
• 1.1.2 主要器材19-20
• 1.1.3 主要試劑20-21
• 1.1.4 溶液配制21
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法21-27
• 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)21-22
• 1.2.2 MTT檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)及相對(duì)活力22
• 1.2.3 熒光定量PCR法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞megalin和cubilin表達(dá)22-25
• 1.2.4 免疫熒光法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞megalin和cubilin的表達(dá)25-26
• 1.2.5 NRK-52E細(xì)胞對(duì)TRITC-albumin的攝取26-27
• 1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析27
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-37
• 1.3.1 NRK-52E細(xì)胞形態(tài)27
• 1.3.2 胰島素干預(yù)濃度的確定27-28
• 1.3.3 NRK-52E細(xì)胞megalin和cubilin的mRNA表達(dá)量28-30
• 1.3.4 NRK-52E細(xì)胞megalin的熒光表達(dá)量30-32
• 1.3.5 NRK-52E細(xì)胞cubilin的熒光表達(dá)量32-34
• 1.3.6 胰島素干預(yù)NRK-52E細(xì)胞后TRITC-albumin的攝取量34-37
• 1.4 討論37-40
• 1.4.1 高胰島素血癥與糖尿病腎病37-38
• 1.4.2 糖尿病中腎小管系統(tǒng)的改變38
• 1.4.3 腎臟白蛋白的攝取38-40
• 1.5 小結(jié)40-41
• 二、高濃度胰島素對(duì)NRK-52E細(xì)胞葡萄糖重吸收的影響41-69
• 2.1 對(duì)象和方法42-50
• 2.1.1 研究對(duì)象42
• 2.1.2 主要器材42
• 2.1.3 主要試劑42
• 2.1.4 熒光定量PCR法測(cè)各葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量變化42-44
• 2.1.5 Western Blot法檢測(cè)各葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白44-49
• 2.1.6 免疫熒光法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞各葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)49-50
• 2.1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析50
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-63
• 2.2.1 NRK-52E細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體m RNA水平表達(dá)量50-53
• 2.2.2 胰島素不同干預(yù)時(shí)間下葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)量變化53-56
• 2.2.3 不同胰島素濃度干預(yù)后NRK-52E細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白水平表達(dá)量56-57
• 2.2.4 胰島素不同干預(yù)時(shí)間下NRK-52E細(xì)胞各葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白水平表達(dá)量57-59
• 2.2.5 免疫熒光法觀察不同濃度胰島素干預(yù)后各葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)59-62
• 2.2.6 NRK-52E細(xì)胞對(duì) 2-NDBG的攝取62-63
• 2.3 討論63-68
• 2.3.1 腎臟的葡萄糖代謝63-65
• 2.3.2 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體65-66
• 2.3.3 胰島素與腎臟糖代謝66-68
• 2.4 小結(jié)68-69
• 三、高濃度胰島素對(duì)NRK-52E細(xì)胞INS/IRS-1/PI3-K/Akt通路的影響69-78
• 3.1 對(duì)象和方法69-71
• 3.1.1 研究對(duì)象69-70
• 3.1.2 主要器材70
• 3.1.3 主要試劑70
• 3.1.4 熒光定量PCR法測(cè)IRS-1、PI3-K變化70-71
• 3.1.5 Western Blot法檢測(cè)胰島素信號(hào)通路變化71
• 3.1.6 PI3-K抑制劑對(duì)NRK-52E細(xì)胞受體表達(dá)的影響71
• 3.1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析71
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果71-76
• 3.2.1 NRK-52E細(xì)胞胰島素信號(hào)通路mRNA變化71-72
• 3.2.2 NRK-52E細(xì)胞胰島素信號(hào)通路蛋白變化72
• 3.2.3 PI3-K抑制劑對(duì)胰島素信號(hào)通路的影響72-73
• 3.2.4 信號(hào)通路受抑后NRK-52E細(xì)胞受體表達(dá)73-76
• 3.3 討論76-77
• 3.4 小結(jié)77-78
• 結(jié)論78-79
• 參考文獻(xiàn)79-87
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明87-88
• 綜述 胰島素抵抗/高胰島素血癥導(dǎo)致的腎小管結(jié)構(gòu)及其功能損傷及其機(jī)制88-105
• 綜述參考文獻(xiàn)97-105
• 致謝105-106
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷106

，

本文編號(hào)：663186