本文關(guān)鍵詞：TXNIP在高糖誘導(dǎo)小鼠腎小球系膜細(xì)胞自噬中的作用及分子機(jī)制

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【摘要】：目的:糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,糖尿病患者一旦出現(xiàn)明顯蛋白尿則病情通常難以逆轉(zhuǎn),往往發(fā)展至終末期腎功能衰竭,是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因之一。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞自噬(Autophagy)在DN中扮演著重要的角色。自噬是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)基本過(guò)程,它將細(xì)胞內(nèi)成分運(yùn)輸?shù)饺苊阁w降解,維持著體內(nèi)平衡和細(xì)胞完整性。正常情況下,細(xì)胞自噬功能處于基礎(chǔ)水平,以維持細(xì)胞正常的生理功能。越來(lái)越多的研究表明,細(xì)胞自噬受損與糖尿病腎病之間密切相關(guān),并參與了糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。在STZ誘導(dǎo)的早期糖尿病小鼠腎小管上皮細(xì)胞中,自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II和自噬溶酶體降解產(chǎn)物P62表達(dá)增多提示自噬活性可能減弱。硫氧還蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin interacting protein,TXNIP)在細(xì)胞內(nèi)普遍存在,高糖能夠誘導(dǎo)TXNIP過(guò)表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),引起細(xì)胞損傷和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們先前已有研究表明高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞TXNIP表達(dá)明顯上調(diào),活性氧(Reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增多,系膜細(xì)胞出現(xiàn)凋亡與表型轉(zhuǎn)化。目前,有研究結(jié)果顯示,糖尿病腎病患者的腎小管上皮細(xì)胞自噬活性減弱,自噬體累積過(guò)多,自噬標(biāo)志蛋白LC3-II和溶酶體降解標(biāo)記物P62表達(dá)增高;在腎小管上皮HK-2細(xì)胞中,敲低TXNIP后自噬活性明顯增強(qiáng),提示TXNIP與糖尿病腎小管細(xì)胞自噬損傷有關(guān)。但是,TXNIP在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞自噬中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)的小鼠系膜細(xì)胞(Mouse mesangial cells,MMCs),研究高糖條件下MMC細(xì)胞中TXNIP與自噬的關(guān)系并探索其相關(guān)分子機(jī)制。方法:p BAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA干擾質(zhì)粒,使用Fu GENE~R6轉(zhuǎn)染試劑將TXNIP siRNA質(zhì)粒和空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MMCs在37°C,5%CO_2培養(yǎng)箱中,以含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,并將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組:(1)正常對(duì)照組(5.5 mmol/L glucose,NG)、甘露醇對(duì)照組(5.5 mmol/L glucose+24.5mmol/L mannitol,M)、高糖組(30 mmol/L glucose,HG)干預(yù)刺激2、6、12、24、48、72小時(shí)后收集細(xì)胞;(2)正常對(duì)照組(5.5 mmol/L glucose,NG)、甘露醇對(duì)照組(5.5 mmol/L glucose+24.5mmol/L mannitol,M)、高糖組(30 mmol/L glucose,HG)、空白質(zhì)粒對(duì)照組(30 mmol/L glucose+p BAsim-U6-Neo質(zhì)粒,HG+V)、TXNIP siRNA敲低組(30 mmol/L glucose+p BAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA質(zhì)粒,HG+T)、巴佛洛霉素組(5.5mmol/L glucose+50 nmol/L Bafilomycin A1,BA組)、硝基酪氨酸組(30mmol/L glucose+p BAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA質(zhì)粒+0.02 mg/ml Nitrotyrosine,HG+T+N)、雷帕霉素組(30 mmol/L glucose+1 ng/ml Rapamycin,HG+R)都在干預(yù)刺激24小時(shí)后收集細(xì)胞。采用Western blot檢測(cè)TXNIP、LC3-II、P62、Nitrotyrosine和p-m TORC1蛋白表達(dá);采用Real-time PCR檢測(cè)TXNIP、LC3-II和P62 m RNA表達(dá);倒置顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué);透射電鏡和共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬體;流式細(xì)胞術(shù)和Mito SOX檢測(cè)ROS。結(jié)果:1 高糖對(duì)系膜細(xì)胞自噬的影響。與正常對(duì)照組相比,經(jīng)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞中TXNIP、LC3-II和P62的表達(dá)隨時(shí)間點(diǎn)呈波峰變化,且在24h時(shí)達(dá)到峰值;甘露醇對(duì)照組中系膜細(xì)胞中TXNIP、P62及LC3-II表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。2 系膜細(xì)胞的形態(tài)變化。倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示,正常對(duì)照組及甘露醇對(duì)照組中系膜細(xì)胞呈星多角形、不規(guī)則、貼壁生長(zhǎng);經(jīng)高糖和巴佛洛霉素A1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞呈橢圓形、與瓶底的粘附性下降;而TXNIP敲低組的系膜細(xì)胞形態(tài)相比高糖組呈多角形、與瓶底粘附性增高。3 敲低TXNIP對(duì)高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞自噬體的影響。透射電鏡觀察結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,經(jīng)高糖和巴佛洛霉素A1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞中檢測(cè)到自噬體明顯增多;而甘露醇對(duì)照組無(wú)明顯改變;TXNIP敲低組相比于高糖組,自噬體明顯減少。4 敲低TXNIP對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。與正常對(duì)照組相比,經(jīng)高糖和巴佛洛霉素A1誘導(dǎo)之后,系膜細(xì)胞中TXNIP、LC3-II、P62和p-m TORC1表達(dá)顯著增高;而甘露醇對(duì)照組系膜細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯變化;TXNIP敲低組系膜細(xì)胞中的TXNIP、LC3-II、P62和p-m TORC1相比于高糖組表達(dá)明顯減少。5 敲低TXNIP對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞ROS的影響。與正常對(duì)照組相比,經(jīng)高糖、巴佛洛霉素A1誘導(dǎo)之后,系膜細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生增多;然而,相比于高糖組,TXNIP敲低組及硝酸酪氨酸組系膜細(xì)胞中ROS生成明顯減少。6 雷帕霉素對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞自噬的影響與正常對(duì)照組相比,經(jīng)高糖誘導(dǎo)之后,系膜細(xì)胞中TXNIP、LC3-II、P62、p-m TORC1和Nitrotyrosine表達(dá)增高;經(jīng)雷帕霉素處理之后系膜細(xì)胞中TXNIP、LC3-II、P62、p-m TORC1和Nitrotyrosine的表達(dá)明顯減少。結(jié)論:1 HG可能抑制MMC細(xì)胞自噬活性。2 HG誘導(dǎo)MMC細(xì)胞中TXNIP過(guò)表達(dá),系膜細(xì)胞自噬體增多。3 敲低TXNIP可能通過(guò)減少ROS產(chǎn)生,減少LC3-II、P62的表達(dá),通過(guò)m TOR信號(hào)通路,使HG誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬活性增加。
【關(guān)鍵詞】：硫氧還蛋白相互作用蛋白 自噬 高糖 系膜細(xì)胞 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II 泛素結(jié)合蛋白P62 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-24
• 結(jié)果24-26
• 附圖26-36
• 討論36-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-45
• 綜述 自噬與糖尿病腎病關(guān)系的研究進(jìn)展45-56
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 致謝56-57
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷57

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