本文關(guān)鍵詞：外源性鈣對(duì)氟致小鼠成骨細(xì)胞增殖及Wnt信號(hào)通路的影響

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【摘要】：[目的]通過檢測(cè)Wnt通路抑制劑和不同水平鈣對(duì)氟中毒小鼠成骨細(xì)胞增殖過程中Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平的變化,探究氟致小鼠成骨細(xì)胞增殖的作用機(jī)理以及適當(dāng)劑量的鈣對(duì)氟中毒的緩解作用,為有效防治氟中毒提供理論依據(jù)。[方法]取出生24h內(nèi)的小鼠顱骨,采用階段性酶消化法分離純化培養(yǎng)細(xì)胞,經(jīng)HE、吉姆薩、堿性磷酸酶和鈣化結(jié)節(jié)染色鑒定為成骨細(xì)胞后,進(jìn)行成骨細(xì)胞的傳代,取第三代生長(zhǎng)狀況良好的小鼠成骨細(xì)胞隨機(jī)分為7組。每組進(jìn)行如下處理：對(duì)照組(C)用正常DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng),攻氟組(F)分別添加10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L濃度的氟化鈉,氟加抑制劑組(F+Y)添加10-6mol/L的氟化鈉和5μg/mL的Wnt通路抑制劑DKK1,抑制劑組(Y)添加5μg/mL的DKK1,氟加低鈣組(F+Cal)在攻氟組培養(yǎng)液中添加1mmol/L的氯化鈣,氟加中鈣組(F+Call)在攻氟組培養(yǎng)液中添加2mmol/L的氯化鈣,氟加高鈣組(F+Calll)在攻氟組培養(yǎng)液中添加4mmol/L的氯化鈣。試驗(yàn)周期為24h。使用MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖情況,使用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)水平,使用細(xì)胞免疫熒光、激光共聚焦、Western blotting技術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。[結(jié)果]1.本試驗(yàn)采用酶消化法成功從小鼠顱骨中分離出細(xì)胞并培養(yǎng),利用HE、吉姆薩、堿性磷酸酶、茜素紅多種染色法鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為成骨細(xì)胞。2.10-8、10-7、10-6mol/L的氟對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用,10-5mol/L的氟對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用不顯著,10-4mol/L的氟對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖有抑制作用。3.體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞24h時(shí),氟對(duì)其增殖率影響最顯著。4.Wnt通路抑制劑明顯抑制了氟致小鼠成骨細(xì)胞的增殖。5.10-6mol/L的氟能夠促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞中Wnt3a、β-Catenin、C-myc基因mRNA水平的表達(dá),添加2mmol/L的鈣有效抑制了氟致小鼠成骨細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。6.10-6mol/L的氟能夠促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞中β-Catenin、Wnt3a、C-myc和CyclinD1蛋白的表達(dá),抑制GSK3β蛋白的表達(dá),添加2mmol/L的鈣有效抑制了氟致小鼠成骨細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)。[結(jié)論]10-6mol/L的氟通過激活Wnt信號(hào)通路促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞增殖,補(bǔ)充2mmol/L的鈣能有效緩解氟對(duì)成骨細(xì)胞的毒性作用。
【關(guān)鍵詞】：氟 鈣 成骨細(xì)胞 增殖 Wnt通路
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R595;R68
【目錄】：

• 摘要7-9
• 文獻(xiàn)綜述9-12
• 前言12-13
• 第一章 體外小鼠成骨細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定13-23
• 1 材料與方法13-16
• 1.1 試驗(yàn)材料13-14
• 1.2 試驗(yàn)方法14-16
• 1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)16
• 2 試驗(yàn)結(jié)果16-20
• 2.1 小鼠成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)16-17
• 2.2 小鼠成骨細(xì)胞的傳代培養(yǎng)17
• 2.3 小鼠成骨細(xì)胞的鑒定17-18
• 2.4 不同氟濃度對(duì)體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞增殖的影響18-19
• 2.5 Wnt通路抑制劑(DKK1)對(duì)體外培養(yǎng)氟致小鼠成骨細(xì)胞增殖率的影響19-20
• 3 討論與分析20-22
• 3.1 小鼠成骨細(xì)胞的原代分離及其傳代培養(yǎng)20-21
• 3.2 小鼠成骨細(xì)胞的鑒定21
• 3.3 不同氟濃度對(duì)體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞增殖的影響21-22
• 3.4 DKK1對(duì)體外培養(yǎng)氟致小鼠成骨細(xì)胞增殖率的影響22
• 4 小結(jié)22-23
• 第二章 不同劑量鈣對(duì)氟致小鼠成骨細(xì)胞增殖Wnt通路相關(guān)基因的影響23-33
• 1 材料與方法23-28
• 1.1 試驗(yàn)材料23-24
• 1.2 試驗(yàn)方法24-27
• 1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)27-28
• 2 試驗(yàn)結(jié)果28-30
• 2.1 RNA的完整性和純度28
• 2.2 不同劑量鈣和DKK1對(duì)氟致小鼠成骨細(xì)胞增殖基因表達(dá)的影響28-30
• 3 討論與分析30-32
• 4 小結(jié)32-33
• 第三章 不同劑量鈣對(duì)氟致小鼠成骨細(xì)胞增殖Wnt通路相關(guān)蛋白的影響33-44
• 1 材料與方法33-38
• 1.1 試驗(yàn)材料33-35
• 1.2 試驗(yàn)方法35-38
• 1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)38
• 2 試驗(yàn)結(jié)果38-42
• 2.1 激光共聚焦檢測(cè)氟致小鼠成骨細(xì)胞增殖β-Catenin蛋白表達(dá)的影響38-39
• 2.2 免疫熒光檢測(cè)不同劑量鈣和DKK1對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖Wnt3a蛋白表達(dá)的影響39-40
• 2.3 免疫熒光檢測(cè)不同劑量鈣和DKK1對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖CyclinD1蛋白表達(dá)的影響40
• 2.4 Western blotting檢測(cè)不同劑量鈣和DKK1對(duì)氟致小鼠成骨細(xì)胞增殖GSK3β蛋白表達(dá)量的影響40-41
• 2.5 Western blotting檢測(cè)不同劑量鈣和DKK1對(duì)氟致小鼠成骨細(xì)胞增殖C-myc蛋白表達(dá)量的影響41
• 2.6 Western blotting檢測(cè)不同劑量鈣和DKK1對(duì)氟致小鼠成骨細(xì)胞增殖β-Catenin蛋白表達(dá)量的影響41-42
• 3 討論與分析42-43
• 4 小結(jié)43-44
• 全文結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-51
• Abstract51-53
• 致謝53

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本文編號(hào)：571759