發(fā)布時間：2017-07-15 17:29

  本文關鍵詞：抗卵泡刺激素受體（FSHR）納米抗體對于實驗動物骨質疏松癥作用效果的研究

  更多相關文章： 卵泡刺激素 納米抗體 亮丙瑞林 骨質疏松癥

【摘要】：骨質疏松(Osteoporosis)是指在骨形成過程中,破骨細胞增長速率大于成骨細胞的增長。卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)是垂體前葉嗜堿粒細胞分泌的一種激素,主要作用為促進卵泡成熟,在絕經前和絕經后女性骨代謝調節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。研究表明,FSH水平增高與性機能減退引起的骨質疏松有密切關系,并且FSH對骨質的作用不依賴于雌激素水平的變化,阻斷FSH的作用不僅能通過抑制骨的再吸收而顯著減少骨的流失,而且還能促進骨的重建。在成年人和動物中,FSHR主要表達在睪丸支持細胞和卵巢粒層細胞表面,FSHR也在成熟的人破骨細胞(OC)及破骨細胞前體即單核細胞表面表達,成為阻斷FSH作用的潛在靶點。據報道,FSH與骨質疏松(OP)具有密切聯(lián)系,在一定范圍內阻斷FSH水平的升高在骨質疏松癥的治療方面已經取得了一定效果。納米抗體作為一種新型的單域抗體具有分子量小、穩(wěn)定性好、可溶性高,易與受體結合等優(yōu)勢從而發(fā)揮一定的生理功能。本研究的主要目的在于制備抗FSHR納米抗體,探討FSHR抗體對實驗大鼠骨質疏松癥的治療效果,主要包括以下幾部分內容:1、噬菌體展示技術從駱駝免疫抗體文庫中篩選抗FSHR納米抗體對FSHR免疫的駱駝VHH噬菌體展示文庫經過3輪淘洗篩選,獲得了63個陽性克隆,其中選擇豐度最高的2個克隆VHH-3F9與VHH-3F19,豐度較低的一個序列VHH-3F20以及單獨序列中隨機的2個VHH-3F8與VHH-3F10等5個VHH基因序列,將其構建至pET22b載體,IPTG誘導蛋白表達,Ni-離子親和色譜純化抗體蛋白,獲得了以上5個抗FSHR納米抗體。經ELISA驗證只有VHH-3F9與VHH-3F19能與FSHR結合,且VHH-3F9結合能力較高,另外4個納米抗體不結合。從而獲得了可以在上清和胞間質均表達的抗FSHR納米抗體VHH-3F9,且濃度及純度較高。ELISA及Western Blot檢測該抗體能與FSHR特異性結合,且VHH-3F9納米抗體具有部分體外阻斷能力,測定其溫度穩(wěn)定性得知在37℃處理12 h仍保留70%的活性。2、制備抗FSHR駱駝多克隆抗體以原核表達純化的fshr234蛋白為抗原,對新疆雙峰駝進行免疫,每隔兩周加強免疫,共免疫七次。在第七次加強免疫兩周后,對駱駝進行免疫后采血,間接elisa法測定抗fshr多克隆抗體的血清效價達到128000大量收集駱駝免疫后血清,采用proteina柱子親和純化駱駝未免疫血清與免疫后血清,獲得抗fshr駱駝多克隆抗體總igg。elisa測得駱駝抗fshr多克隆抗體igg的最低反應濃度為0.0625μg/ml。體外檢測抗fshr抗體與caov-3細胞表面fshr的結合,細胞免疫化學實驗結果表明vhh-3f9納米抗體和抗fshr駱駝多克隆抗體igg與caov-3細胞表面的fshr均有結合,且多抗igg結合能力較高,vhh-3f9有部分結合能力。3、利用雙側卵巢切除建立sd大鼠骨質疏松癥模型本研究中實驗動物sd大鼠隨機分為兩組,分別是去勢ovx組和對照sham組。去勢后檢測雌二醇(e2)、卵泡刺激素(fsh)、黃體生成素(lh)等雌激素水平以及骨密度(bmd)以評價建立的骨質疏松癥動物模型。實驗結果發(fā)現(xiàn)10周齡大鼠去勢2周后,與sham組相比,ovx組e2水平顯著下降(p0.01),且在2到5周內保持平穩(wěn)狀態(tài)。fsh及l(fā)h水平均顯著增加(p0.05),且在2到5周內增加趨勢緩慢,達到相對穩(wěn)定水平。繼續(xù)飼養(yǎng)3周,即去勢8周后測定sd大鼠骨密度(bmd)水平,結果表明ovx組骨密度顯著低于sham組(p0.05),從而驗證骨質疏松癥模型成立。4、抗fshr抗體對sd大鼠骨質疏松癥的治療采用尾靜脈注射治療骨質疏松癥sd大鼠,納米抗體vhh-3f9以及駱駝抗fshr多克隆抗體igg,按相同劑量即2mg/kg,亮丙瑞林(le)按1.6mg/kg,對照組注射200μl的pbs。各組每周均治療2次,共治療6周。采血進行血清各項指標檢測,觀察每組對sd大鼠骨質疏松癥的影響。實驗結果發(fā)現(xiàn),與對照sham組相比,實驗組e2水平均顯著降低(p0.05),而各組之間并無差異。隨著去勢后ovx組fsh水平的逐漸增加,vhh-3f9、igg注射骨質疏松癥sd大鼠明顯抑制了fsh的增加,且igg效果強于vhh-3f9,但是差異并不顯著。ovx+le組,隨著注射le時間的延長,FSH水平顯著降低,發(fā)現(xiàn)LE的施加顯著抑制FSH(P0.05)。LH的變化與FSH趨勢一致,但OVX+VHH-3F9組LH水平高于OVX+IgG組。從而通過抑制FSH而達到治療骨質疏松癥的目的。綜上所述,本研究在建立SD大鼠骨質疏松癥動物模型的基礎上,通過從噬菌體免疫文庫中篩選得到親和力較高的抗FSHR納米抗體,免疫駱駝得到效價較高的抗FSHR多克隆抗體IgG,并用于實驗動物SD大鼠骨質疏松癥的治療,以亮丙瑞林作為抑制FSH激素水平的對照,以確定抗FSHR抗體對于大鼠骨質疏松癥的治療效果。為將來進一步預防骨質疏松篩選有效藥物做一基礎研究,以便用于臨床診斷及骨質疏松癥的預防。
【關鍵詞】：卵泡刺激素 納米抗體 亮丙瑞林 骨質疏松癥
【學位授予單位】：新疆大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R580
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-10
• 英文縮略詞10-15
• 第一部分 文獻綜述15-30
• 1 促性腺激素與骨質疏松癥的關系15-18
• 1.1 卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）及其生理作用15
• 1.2 黃體生成素（Luteinizing Hormone，，LH）及其生理作用15-16
• 1.3 FSH與LH在卵泡成熟過程中存在的相互關系16
• 1.4 亮丙瑞林（LE）簡介16-17
• 1.5 促性腺激素與骨質疏松之間的關系17-18
• 2 納米抗體的研究概況18-20
• 2.1 納米抗體的簡介18
• 2.2 納米抗體在研究領域的應用18-20
• 3 骨質疏松癥的治療20-23
• 3.1 骨質疏松癥簡介20-21
• 3.2 骨質疏松癥研究進展21
• 3.3 FSH對骨質疏松癥的影響21-22
• 3.4 骨質疏松癥的治療22-23
• 參考文獻23-30
• 第二部分 實驗研究30-76
• 第一章 利用噬菌體展示技術從駱駝抗體文庫中篩選抗FSHR納米抗體30-51
• 1 材料與方法31-36
• 1.1 材料31-33
• 1.1.1 實驗材料31
• 1.1.2 試劑31
• 1.1.3 儀器31-32
• 1.1.4 培養(yǎng)基及溶液配制32-33
• 1.2 方法33-36
• 1.2.1 噬菌體的分離與擴增33-34
• 1.2.2 抗FSHR納米抗體的親和篩選34
• 1.2.3 多克隆Phage ELISA34-35
• 1.2.4 原核表達載體pET22b-VHH-3F9的構建35
• 1.2.5 VHH-3F9納米抗體的制備35
• 1.2.6 VHH-3F9納米抗體的結合活性檢測35-36
• 1.2.7 競爭ELISA檢測VHH-3F9的阻斷能力36
• 2 結果與分析36-46
• 2.1 抗原FSHR234蛋白的獲得36-37
• 2.2 FSHR234蛋白對噬菌體免疫文庫的篩選37-39
• 2.3 FSHR234抗原篩選獲得的VHH-X基因序列分析39-40
• 2.4 pMECS-VHH-X重組質粒的提取及其酶切40-42
• 2.5 BL21-pET22b-VHH-3F8、3F10、3F9、3F19及 3F20轉化子的鑒定42
• 2.6 納米抗體VHH-3F9的誘導表達及其純化42-44
• 2.7 納米抗體VHH-3F9的結合活性檢測44-45
• 2.8 競爭ELISA檢測VHH-3F9的阻斷功能45-46
• 3 討論46-48
• 參考文獻48-51
• 第二章 抗FSHR駱駝多克隆抗體的制備51-60
• 1 材料與方法52-54
• 1.1 材料52
• 1.2 方法52-54
• 1.2.1 FSHR234蛋白免疫新疆雙峰駝及其血清的采集52
• 1.2.2 駱駝來源抗FSHR多克隆抗體的純化52-53
• 1.2.3 間接ELISA法檢測抗FSHR多克隆抗體的最低結合濃度53
• 1.2.4 Western Blot檢測抗FSHR多克隆抗體結合特異性53
• 1.2.5 細胞免疫化學檢測抗FSHR抗體在caov-3 細胞表面的結合53-54
• 2 結果54-58
• 2.1 駱駝來源抗FSHR多克隆抗體的純化54-56
• 2.2 抗FSHR多克隆抗體的最低結合濃度測定56
• 2.3 Western Blot檢測駱駝抗FSHR多克隆抗體結合特異性56
• 2.4 細胞免疫化學檢測抗FSHR抗體在caov-3 細胞表面的結合56-58
• 3 討論58
• 參考文獻58-60
• 第三章 SD大鼠骨質疏松癥動物模型的建立60-68
• 1 材料與方法61-62
• 1.1 材料61
• 1.2 方法61-62
• 1.2.1 SD大鼠骨質疏松模型的建立61
• 1.2.2 大鼠血生化指標及雌激素水平測定61
• 1.2.3 大鼠骨密度（BMD）測定61-62
• 1.2.4 數據處理及分析62
• 2 結果62-64
• 2.1 動物生長常規(guī)觀察62
• 2.2 大鼠血鈣（S-Ca）、血磷（S-P）含量測定62-63
• 2.3 大鼠血清E2、FSH、LH水平測定63-64
• 2.4 大鼠骨密度（BMD）檢測64
• 3 討論64-65
• 參考文獻65-68
• 第四章 抗FSHR抗體對實驗大鼠骨質疏松癥的治療68-76
• 1 材料69
• 1.1 實驗動物及分組69
• 1.2 試劑配置69
• 2 方法69-70
• 2.1 大鼠骨質疏松模型的治療69
• 2.2 抗FSHR抗體治療SD大鼠雌激素及BMD檢測69-70
• 2.3 免疫組化觀察SD大鼠骨組織病理學變化70
• 3 結果70-73
• 3.1 治療過程中SD大鼠體重的變化70
• 3.2 抗體治療SD大鼠雌激素及BMD檢測70-72
• 3.3 抗體治療SD大鼠組織病理學觀察72-73
• 4 討論73-74
• 參考文獻74-76
• 第三部分 結論與展望76-77
• 1 結論76
• 2 展望76-77
• 致謝77-79
• 個人簡歷79
• 參與課題79
• 發(fā)表文章79-80

【相似文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 雷雪芹,陳宏,袁志發(fā),徐廷生,雷初朝,孫維斌;牛FSHR基因第10外顯子單核苷酸多態(tài)性及其與雙胎性狀的關系[J];中國生物化學與分子生物學報;2004年01期

2 雷池月;鞏轉娣;韋敏;歐陽霞輝;謝坤;陳士恩;魏鎖成;;阿拉瑞林免疫影響FSHR表達及FSHR生物信息學分析[J];中國免疫學雜志;2014年07期

3 周立花;李汶;盧光t;;FSHR、LHR基因突變與多態(tài)對女性生殖的影響[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2010年01期

4 楊利華;李晉濤;梁志清;吳玉章;何畏;;卵泡刺激素受體(FSHR_(32-44))肽疫苗對雄性小鼠生殖器官影響[J];免疫學雜志;2012年09期

5 張哲;鄭清蓮;劉永惠;;去卵巢大鼠腎臟組織表達FSHR和LHR[J];基礎醫(yī)學與臨床;2012年10期

6 閻萍;申子剛;何畏;陳正瓊;何海洋;張記;楊霞;唐艷;吳玉章;梁志清;李晉濤;;FSHR胞外區(qū)基因片段的原核表達及多克隆抗體的制備[J];免疫學雜志;2009年04期

7 魏鎖成;鞏轉娣;董江陵;謝坤;李瓊毅;韋敏;;Alarelin免疫綿羊對垂體GnRHR、FSHR和LHR基因表達與生殖激素分泌的作用[J];基礎醫(yī)學與臨床;2012年10期

8 申可佳;熊桀;尤昭玲;雷磊;付靈梅;尹香花;劉艷;;護卵湯對GnRHa超排卵大鼠卵巢FSHR和LHR蛋白表達的影響[J];湖南中醫(yī)藥大學學報;2013年07期

9 朱秀蘭;馬文麗;德偉;彭翼飛;陰常欣;鄭文嶺;;FSHR部分基因的真核表達質粒構建和生物信息學分析[J];熱帶醫(yī)學雜志;2009年03期

10 匡野;龐海燕;肖曉輝;劉國藝;溫海霞;;大豆異黃酮對圍絕經期大鼠卵巢FSHR表達的影響[J];中國中醫(yī)藥科技;2011年04期

中國重要會議論文全文數據庫 前10條

1 康麗;嚴華祥;臧麗;梁森;張渝潔;劉東君;張寧波;唐輝;王慧;楊長鎖;姜運良;;雞FSHR基因5′調控區(qū)兩個多態(tài)位點及其與產蛋性狀的相關研究[A];第十二次全國畜禽遺傳標記研討會論文集[C];2010年

2 邱榮;王樹迎;劉曉東;黃麗波;侯衍猛;;山羊發(fā)情周期中FSHR在輸卵管內的定位研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物解剖學及組織胚胎學分會第十六次學術研討會論文集[C];2010年

3 袁櫟;佟輝;德偉;;FSHR抗原表位融和蛋白的克隆及表達[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2008年學術交流會論文摘要匯編[C];2008年

4 徐日福;陳繼蘭;徐慧;趙麗紅;劉基偉;秦寧;楊雨江;;雞FSHR基因mRNA組織表達特性的研究[A];中國動物遺傳育種研究進展——第十五次全國動物遺傳育種學術討論會論文集[C];2009年

5 劉曉東;王慧;王樹迎;邱榮;侯衍猛;黃麗波;;FSHR在山羊發(fā)情周期不同階段卵巢中的定位研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物解剖學及組織胚胎學分會第十六次學術研討會論文集[C];2010年

6 陳寶劍;何荊洲;蔣欽楊;毛獻寶;鄭自華;韋英明;;四種牛FSHR基因第10外顯子的克隆與分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物繁殖學分會第十五屆學術研討會論文集（上冊）[C];2010年

7 趙艷麗;李向軍;王婕;姜懷志;;山羊FSHR基因第10外顯子單核苷酸 多態(tài)性及其與雙羔性狀間關系的研究[A];吉林省畜牧獸醫(yī)學會2007學術年會論文集[C];2007年

8 于俊娜;滑國華;熊家軍;張軍民;楊利國;;促卵泡素受體(FSHR)基因多態(tài)性及其與牛精液品質的關聯(lián)分析[A];中國奶業(yè)協(xié)會年會論文集2008（上冊）[C];2008年

9 邱榮;王慧;王樹迎;劉曉東;黃麗波;侯衍猛;;山羊輸卵管FSHR基因在發(fā)情周期不同階段的差異表達[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物解剖學及組織胚胎學分會第十六次學術研討會論文集[C];2010年

10 張寧波;丁修良;曹貴玲;宋春紅;楊曉慧;姜運良;;雞FSHR、BMPR-Ⅰ B和IGFBP-4 mRNA在卵巢組織和卵泡的表達動態(tài)分析[A];中國家禽業(yè)——機遇與挑戰(zhàn)——第十三次全國家禽學術討論會論文集[C];2007年

中國博士學位論文全文數據庫 前9條

1 Nabeel Ijaz;FSHβ基因變化的驅動力和FSHR基因的遺傳效應[D];華中農業(yè)大學;2016年

2 魏伍川;牛、羊FSHR基因5'端轉錄啟動調控區(qū)和部分結構區(qū)序列的研究[D];西北農林科技大學;2000年

3 黃賀;北極狐ESR和FSHR基因多態(tài)性、表達及其與產仔關系的研究[D];東北林業(yè)大學;2013年

4 李迎春;FSHR多肽免疫效應及FSHR基因多態(tài)與男性不育相關性研究[D];南京醫(yī)科大學;2010年

5 楊利華;基于卵泡雌激素受體-FSHR多肽避孕疫苗的優(yōu)化設計及其抗生育效應的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2011年

6 郭洪勝;PCOS動物模型及PCOS患者CYP19、GATA-4、FSHR基因表達的初步研究[D];南方醫(yī)科大學;2010年

7 康麗;雞卵泡發(fā)育相關基因和miRNA的鑒定及功能分析[D];山東農業(yè)大學;2009年

8 張寧波;雞繁殖性狀相關基因及卵巢組織差異表達基因研究[D];山東農業(yè)大學;2007年

9 宋陽;高卵泡刺激素對絕經后女性低密度脂蛋白代謝的作用機制研究[D];浙江大學;2013年

中國碩士學位論文全文數據庫 前10條

1 金慧慧;轉豬FSHR和KISS1基因小鼠繁殖性能分析[D];西南大學;2015年

2 徐萍萍;基于FSHR表位肽的納米避孕疫苗的構建及其體內外效應研究[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

3 木亞沙爾·買買提拉洪(Muyassar . Mamtilahon);卵泡刺激素受體（FSHR）作為抗腫瘤治療分子靶標的研究[D];新疆大學;2015年

4 王藝;FSHβ、FSHR基因多態(tài)性與豬發(fā)情期外周血雌二醇水平的相關性分析[D];南京農業(yè)大學;2014年

5 郭晶;湖羊FSHR和TGF-β1基因核心啟動子區(qū)鑒定與表達調控[D];南京農業(yè)大學;2014年

6 王亞男;京海黃雞FSHβ和FSHR基因的遺傳效應及其表達規(guī)律研究[D];揚州大學;2015年

7 張瑞;揚子鱷卵泡刺激素FSHβ及其受體FSHR的分子結構及在雌性生殖周期中的時空表達變化[D];安徽師范大學;2015年

8 龍威海;黔北麻羊繁殖相關基因mRNA表達水平與多態(tài)性分析[D];貴州大學;2015年

9 王文芳;高原甘加型藏羊發(fā)情周期卵巢FSHR和LHR分布及其mRNA表達規(guī)律研究[D];甘肅農業(yè)大學;2016年

10 謝輝軍;FTO、TNF-α、FSHR基因多態(tài)與多囊卵巢綜合征易感性的相關性研究[D];南華大學;2016年

本文編號：544983