第一部分構(gòu)建大鼠PPARy基因的tet-on慢病毒載體,體外實驗確定載體對大鼠BMSCs成脂與成骨分化的影響目的分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs。構(gòu)建大鼠PPARy基因shRNA的Tet-on慢病毒載體,并轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs,在四環(huán)素的誘導(dǎo)下確定其沉默效應(yīng)及對大鼠BMSCs成脂與成骨分化的影響。方法采用貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs, SABC法進行鑒定。針對大鼠PPARγ基因特異序列,通過質(zhì)粒重組、病毒包裝及測序驗證,構(gòu)建pTRIPZ/PPARy-shRNA慢病毒載體,設(shè)空白對照組(Control組)、非特異性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(shNTC)、慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(shPPARγ)。分別轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs后,在四環(huán)素誘導(dǎo)下確定其沉默效應(yīng)及最佳四環(huán)素誘導(dǎo)濃度。成脂誘導(dǎo)后RT-PCR檢測成脂基因C/EBPα ADD1 mRNA的表達,Western blotting檢測C/EBPα ADD1蛋白的表達,油紅O染色檢測其成脂細胞分化。成骨誘導(dǎo)后RT-PCR檢測成骨基因collagenI和Cbfa1/Runx2的表達,Western blotting檢測collagen I和Cbfa1/Runx2蛋白的表達,通過...

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１－２?ｐＲｓｖ－ＲＥＶ巧粒圖譜??

ｐＴＲＪＰＺ?（Ｔｒａｎｓｆｅｒ?Ｖｅｃｔｏｒ）。其中Ｔｒａｎｓｆｅｒ?Ｖｅｃｔｏｒ含有能表這紅色焚光蛋白??（加＇ｂｏＲＦＰ）?；?Ｐ民ｓｖ－ＲＥＶ，ｐＭＤｌｇ－ｐ民ＲＥ，ｐＭＤ２Ｇ含有病毒包裝所必須的元件??（見圖１－１？圖１－４）。??ＶＥＣＴＯＲ?ＭＡＰ?麵??Ｏｔｈｅ＊....

圖１－５大鼠ＢＭＳＣｓ原代培養(yǎng)第８天形態(tài)學(xué)觀察（Ｘ２００）??

剛剛接種的大鼠ＢＭＳＣｓ懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)，２４ｈ后貼壁生成，成紡錐形，隨著??逐次換液逐漸去除未貼壁的細胞，而貼壁的紡鏈形細胞越米越多，同時混有一些??雜細胞（見圖１－５），１２－１４ｄ細胞開始傳代，經(jīng)過３次傳代，細胞逐漸純化，形??態(tài)均＾，＾集落樣生長（見圖１－６）。??ＳＡＢＣ....

圖１－６大鼠ＢＭＳＣｓ?Ｐ３代形態(tài)學(xué)觀察（Ｘ２００）??

３．２．１?ｐＳＭ２－ＰＰＡＲｙ設(shè)病奉載體構(gòu)建沖間載體）??將ｐＳＭ２載體及ＰＵＣ５７－ＰＰＡＲＹ質(zhì)粒使用Ｘｈｏ?Ｉ和ＥｃｏＲ?Ｉ進行酶切，產(chǎn)物加??樣到１％的瓊脂糖膠進行電泳鑒定，結(jié)果顯示酶切正確（見圖１－８）。??３６??

圖１－１０），重組質(zhì)粒測??

華中科技大學(xué)博擊學(xué)位論文??ａ調(diào)??準??圖１－６大鼠ＢＭＳＣｓ?Ｐ３代形態(tài)學(xué)觀察（Ｘ２００）??ＣＤ４４＋?ＣＤ５４＋?？?Ｃｆｂ７１＋，，??＼?？?？?ｒ?，濤??、－、?＇ｖ?＾?§＇?Ｊ＊??言＇?準?；＃：？＞？＊?／??ＣＤ３４－?＾０４５－＊＇?？’??為?＇＃?....

本文編號：3891175