氟對ATDC5細胞增殖和分化的影響及生物鐘信號通路在其中的調(diào)控作用
發(fā)布時間：2021-11-06 07:30
目的:氟是人體生長發(fā)育所必需的微量元素,適量的氟可以增強牙齒的抗齲能力,但機體長期攝入過量氟會引起地方性氟中毒。由于骨組織是氟主要的靶器官,因此過量氟引起的氟骨癥是最具代表性的,軟骨損傷是該癥的基本表現(xiàn)之一。軟骨形成過程受到全身激素、細胞因子和局部信號通路的共同調(diào)控。生物鐘是指生理學和行為的每日24小時節(jié)律,由外部時間線索產(chǎn)生的正、負反饋回路組成。正反饋回路由轉(zhuǎn)錄因子Clock和Bmal1組成,負反饋回路由轉(zhuǎn)錄因子Per和Cry組成。氟對軟骨形成過程增殖、分化的影響以及氟是否通過生物鐘信號通路調(diào)控軟骨形成過程尚未見報道。為此,我們通過大鼠孕哺期染毒的初斷乳仔鼠和小鼠ATDC5細胞,初步探索氟對ATDC5細胞體外分化過程的影響和生物鐘信號通路在其中發(fā)揮的作用。本研究擬為闡明氟抑制長骨生長的機制提供線索,為氟骨癥的防治提供理論依據(jù)。實驗方法:本研究選取孕哺期染毒的Wistar初斷乳仔鼠,通過免疫組織化學染色檢測大鼠生長板軟骨中Bmal1蛋白的表達。本研究采用CCK8法確定氟抑制ATDC5細胞增殖的染毒劑量,在胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉誘導劑的作用下誘導ATDC5細胞分化,采用阿利新藍染色法...
【文章來源】：中國醫(yī)科大學遼寧省
【文章頁數(shù)】：52 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
大鼠生長板軟骨細胞Bmal1蛋白的免疫組化染色（20X）
中國醫(yī)科大學碩士學位論文11圖2ATDC5細胞的CCK8細胞活力檢測及阿利新藍染色（A）用不同濃度的NaF處理ATDC5細胞72h，采用CCK-8法檢測細胞存活率。（B）用含或不含10-3MNaF的分化培養(yǎng)液分別培養(yǎng)ATDC5細胞7、14和21天。采用阿利新藍染色法檢測細胞內(nèi)蛋白多糖的合成情況，并用體式顯微鏡對染色后細胞進行拍照（2X）。（C）6M鹽酸胍裂解細胞并用酶標儀檢測裂解液在650nm處的吸光度。實驗結(jié)果以X±SD表示，*P<0.05，**P<0.01，n=3，比例尺為500μm。3.3.氟對小鼠ATDC5細胞分化標志因子的影響3.3.1.氟對小鼠ATDC5細胞分化標志因子mRNA的影響用含有ITS的分化培養(yǎng)液分別培養(yǎng)ATDC5細胞5、7、14和21天，采用實時熒光定量RCR法檢測ATDC5細胞分化標志因子Sox9、Aggrecan、Col2a1、
中國醫(yī)科大學碩士學位論文14圖3ATDC5細胞各時點Sox9、Aggrecan、Col2a1、Ihh和Col10a1的mRNA和蛋白表達用含或不含10-3MNaF的分化培養(yǎng)液分別培養(yǎng)ATDC5細胞5、7、14和21天。（A）采用實時熒光定量PCR法檢測Sox9、Aggrecan、Col2a1、Ihh和Col10a1的mRNA表達。（B）采用免疫印跡法檢測Sox9、Col2a1、Ihh和Col10a1的蛋白表達。（C）以Gapdh為內(nèi)參，定量對照組和染氟組細胞的蛋白表達。實驗結(jié)果以X±SD表示，*P<0.05，**P<0.01，n=3，比例尺為500μm。3.4.氟對小鼠ATDC5細胞內(nèi)CircadianClock信號通路的影響用含有ITS的分化培養(yǎng)液培養(yǎng)ATDC5細胞7天，采用實時熒光定量RCR法和免疫印跡法檢測ATDC5細胞生物鐘信號通路核心分子Bmal1、Clock、Per1和Cry1的mRNA和蛋白的表達。如圖4（A）所示，與對照組相比，染氟組Bmal1和Clock的mRNA表達顯著降低(P<0.05)，Cry1的mRNA表達顯著升高(P<0.05)，Per1的mRNA表達沒有變化。如圖4（B）和4（C）所示，與對照組相比，染氟組Bmal1和Clock的蛋白表達顯著降低（P<0.05)，Cry1和Per1的蛋白表達顯著升高（P<0.05)。圖4ATDC5細胞的Bmal1、Clock、Per1和Cry1的mRNA和蛋白表達用含或不含10-3MNaF的分化培養(yǎng)液培養(yǎng)ATDC5細胞7天。（A）采用實時熒光定量PCR
【參考文獻】：
期刊論文
[1]氟對體外培養(yǎng)軟骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響及SOD對氟的拮抗作用[J]. 于燕妮,蒙炳杰. 中國地方病學雜志. 2006(05)
[2]過量氟對實驗大鼠軟骨細胞分化及Ⅱ和Ⅹ型膠原表型表達的影響[J]. 許鵬,郭雄,姚建鋒,張富軍,耿冬,杜曉陽,蔡乾坤. 中華風濕病學雜志. 2002(04)
[3]過量氟化物對軟骨損傷的研究進展[J]. 許鵬,郭雄. 國外醫(yī)學(醫(yī)學地理分冊). 2001(01)
碩士論文
[1]Sedlin蛋白對人軟骨細胞增殖的影響及作用機制[D]. 胡玉娟.重慶醫(yī)科大學 2014
本文編號：3479441
【文章來源】：中國醫(yī)科大學遼寧省
【文章頁數(shù)】：52 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
大鼠生長板軟骨細胞Bmal1蛋白的免疫組化染色（20X）
中國醫(yī)科大學碩士學位論文11圖2ATDC5細胞的CCK8細胞活力檢測及阿利新藍染色（A）用不同濃度的NaF處理ATDC5細胞72h，采用CCK-8法檢測細胞存活率。（B）用含或不含10-3MNaF的分化培養(yǎng)液分別培養(yǎng)ATDC5細胞7、14和21天。采用阿利新藍染色法檢測細胞內(nèi)蛋白多糖的合成情況，并用體式顯微鏡對染色后細胞進行拍照（2X）。（C）6M鹽酸胍裂解細胞并用酶標儀檢測裂解液在650nm處的吸光度。實驗結(jié)果以X±SD表示，*P<0.05，**P<0.01，n=3，比例尺為500μm。3.3.氟對小鼠ATDC5細胞分化標志因子的影響3.3.1.氟對小鼠ATDC5細胞分化標志因子mRNA的影響用含有ITS的分化培養(yǎng)液分別培養(yǎng)ATDC5細胞5、7、14和21天，采用實時熒光定量RCR法檢測ATDC5細胞分化標志因子Sox9、Aggrecan、Col2a1、
中國醫(yī)科大學碩士學位論文14圖3ATDC5細胞各時點Sox9、Aggrecan、Col2a1、Ihh和Col10a1的mRNA和蛋白表達用含或不含10-3MNaF的分化培養(yǎng)液分別培養(yǎng)ATDC5細胞5、7、14和21天。（A）采用實時熒光定量PCR法檢測Sox9、Aggrecan、Col2a1、Ihh和Col10a1的mRNA表達。（B）采用免疫印跡法檢測Sox9、Col2a1、Ihh和Col10a1的蛋白表達。（C）以Gapdh為內(nèi)參，定量對照組和染氟組細胞的蛋白表達。實驗結(jié)果以X±SD表示，*P<0.05，**P<0.01，n=3，比例尺為500μm。3.4.氟對小鼠ATDC5細胞內(nèi)CircadianClock信號通路的影響用含有ITS的分化培養(yǎng)液培養(yǎng)ATDC5細胞7天，采用實時熒光定量RCR法和免疫印跡法檢測ATDC5細胞生物鐘信號通路核心分子Bmal1、Clock、Per1和Cry1的mRNA和蛋白的表達。如圖4（A）所示，與對照組相比，染氟組Bmal1和Clock的mRNA表達顯著降低(P<0.05)，Cry1的mRNA表達顯著升高(P<0.05)，Per1的mRNA表達沒有變化。如圖4（B）和4（C）所示，與對照組相比，染氟組Bmal1和Clock的蛋白表達顯著降低（P<0.05)，Cry1和Per1的蛋白表達顯著升高（P<0.05)。圖4ATDC5細胞的Bmal1、Clock、Per1和Cry1的mRNA和蛋白表達用含或不含10-3MNaF的分化培養(yǎng)液培養(yǎng)ATDC5細胞7天。（A）采用實時熒光定量PCR
【參考文獻】：
期刊論文
[1]氟對體外培養(yǎng)軟骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響及SOD對氟的拮抗作用[J]. 于燕妮,蒙炳杰. 中國地方病學雜志. 2006(05)
[2]過量氟對實驗大鼠軟骨細胞分化及Ⅱ和Ⅹ型膠原表型表達的影響[J]. 許鵬,郭雄,姚建鋒,張富軍,耿冬,杜曉陽,蔡乾坤. 中華風濕病學雜志. 2002(04)
[3]過量氟化物對軟骨損傷的研究進展[J]. 許鵬,郭雄. 國外醫(yī)學(醫(yī)學地理分冊). 2001(01)
碩士論文
[1]Sedlin蛋白對人軟骨細胞增殖的影響及作用機制[D]. 胡玉娟.重慶醫(yī)科大學 2014
本文編號：3479441
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