目的:成人主動(dòng)脈根部擴(kuò)張及主動(dòng)脈瘤的形成是馬凡氏綜合征最常見(jiàn)的心血管癥狀及并發(fā)癥;主動(dòng)脈血管壁中膜平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）功能障礙是導(dǎo)致病變的關(guān)鍵因素。本研究探討TGF-β介導(dǎo)馬凡氏綜合征主動(dòng)脈VSMCs衰老的機(jī)制,為臨床上馬凡氏綜合征主動(dòng)脈病變的早期干預(yù)和治療提供新的策略和理論基礎(chǔ)。方法:分別選取臨床上器官捐獻(xiàn)供體和行主動(dòng)脈手術(shù)的馬凡氏綜合征患者主動(dòng)脈組織,然后分離、培養(yǎng)、鑒定兩組主動(dòng)脈VSMCs。運(yùn)用H&E染色、SA-β-gal染色、Ki67增殖實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色比較兩組主動(dòng)脈組織中膜VSMCs增殖及衰老情況的差異。ELISA檢測(cè)對(duì)比兩組細(xì)胞培養(yǎng)基中衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）IL-6、IL-8、TNF-α、INF-y的濃度。將供體血管平滑肌細(xì)胞分為三組,其中兩組分別加入TGF-β1（50ng/ml）和TGF-β1+TGF-β1-siRNA干預(yù)48 h后檢測(cè)三組細(xì)胞衰老程度的情況,探討TGF-β誘導(dǎo)主動(dòng)脈VSMCs衰老的作用。運(yùn)用DH... 

【文章來(lái)源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：106 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 馬凡氏綜合征及其并發(fā)癥
    1.2 血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)損傷與主動(dòng)脈瘤
        1.2.1 VSMCs
        1.2.2 VSMCs損傷與主動(dòng)脈瘤的形成
    1.3 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β及其生物學(xué)功能
    1.4 ROS/NF-κB信號(hào)通路與細(xì)胞衰老
        1.4.1 活性氧
        1.4.2 核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)
        1.4.3 衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)
    1.5 研究假設(shè)
第二章 馬凡氏綜合征主動(dòng)脈組織與供體主動(dòng)脈組織衰老表型的比較
    2.1 前言
    2.2 組織標(biāo)本和實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 主動(dòng)脈組織
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 主動(dòng)脈組織的石蠟包埋
        2.3.2 蘇木素伊紅染色(hematoxylin and eosin staining,H&E staining)
        2.3.3 總蛋白質(zhì)的提取
        2.3.4 蛋白質(zhì)濃度測(cè)量
        2.3.5 蛋白質(zhì)垂直凝膠電泳分離
        2.3.6 轉(zhuǎn)膜
        2.3.7 封閉、孵育及顯色分析
        2.3.8 主動(dòng)脈組織切片的SA-β-gal染色
        2.3.9 主動(dòng)脈組織切片衰老相關(guān)蛋白p53和平滑肌細(xì)胞標(biāo)記蛋白α-SMA的免疫熒光染色
        2.3.10 統(tǒng)計(jì)方法
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 MFS患者及器官捐獻(xiàn)供體的基本信息
        2.4.2 MFS患者主動(dòng)脈中膜發(fā)生囊性變并出現(xiàn)退化
        2.4.3 MFS患者主動(dòng)脈組織中細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白表達(dá)增多
        2.4.4 MFS患者主動(dòng)脈組織中發(fā)生衰老的細(xì)胞類(lèi)型主要為中膜平滑肌細(xì)胞
    2.5 實(shí)驗(yàn)討論
    2.6 本章小結(jié)
第三章 馬凡氏綜合征及供體主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞衰老表型的比較
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
        3.3.2 細(xì)胞的凍存
        3.3.3 細(xì)胞的復(fù)蘇
        3.3.4 兩組培養(yǎng)細(xì)胞α-SMA和calponin免疫熒光染色鑒定
        3.3.5 兩組VSMCs形態(tài)大小的比較
        3.3.6 兩組VSMCs SA-β-gal染色
        3.3.7 ki67免疫熒光染色比較兩組VSMCs的增殖能力
        3.3.8 Western Blot法檢測(cè)兩組VSMCs中p53及p21的水平
        3.3.9 ELISA檢測(cè)兩組VSMCs培養(yǎng)基中衰老相關(guān)分泌表型(SASP)水平
        3.3.10 統(tǒng)計(jì)方法
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 器官捐獻(xiàn)供體與MFS患者主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的鑒定
        3.4.2 MFS-VSMCs體積增大,SA-β-gal染色陽(yáng)性率增高,細(xì)胞增殖能力降低
        3.4.3 MFS-VSMCs衰老相關(guān)蛋白p21、p53的表達(dá)增多
        3.4.4 MFS-VSMCs培養(yǎng)基中SASP(IL-6、IL-8、TNF-α、INF-γ)濃度升高
    3.5 實(shí)驗(yàn)討論
    3.6 本章小結(jié)
第四章 TGF-β1誘導(dǎo)主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞衰老的研究
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 MFS患者與器官捐獻(xiàn)供體血清和主動(dòng)脈組織中TGF-β1水平的測(cè)定
        4.3.2 Western Blot檢測(cè)兩組血管平滑肌細(xì)胞中TGF-β1的水平
        4.3.3 siRNA(Small-interfering RNA)沉默目的蛋白基因表達(dá)
        4.3.4 Western Blot檢測(cè)各組Control-VSMCs干預(yù)后TGF-β1、p53、p21水平的變化
        4.3.5 SA-β-gal染色檢測(cè)各組Control-VSMCs干預(yù)后的衰老情況
        4.3.6 統(tǒng)計(jì)方法
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 MFS患者的血清和主動(dòng)脈組織中TGF-β1水平升高
        4.4.2 TGF-β1促進(jìn)Control-VSMCs衰老
    4.5 實(shí)驗(yàn)討論
    4.6 本章小結(jié)
第五章 TGF-β促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞衰老機(jī)制的探討
    5.1 前言
    5.2 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 DHE染色檢測(cè)MFS患者與器官捐獻(xiàn)供體主動(dòng)脈組織中ROS的水平
        5.3.2 線粒體活性氧水平的檢測(cè)(Mito-Sox染色)
        5.3.3 兩組VSMCs NF-κB活化情況比較(p-65- NF-κB免疫熒光染色)
        5.3.4 Western Blot檢測(cè)各組VSMCs干預(yù)后目的蛋白表達(dá)水平變化
        5.3.5 SA-β-gal檢測(cè)各組Control-VSMCs干預(yù)后的衰老情況
        5.3.6 ELISA檢測(cè)各組Control-VSMCs干預(yù)后培養(yǎng)基中SASP的濃度
        5.3.7 統(tǒng)計(jì)方法
    5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.4.1 MFS患者主動(dòng)脈組織及細(xì)胞線粒體中ROS水平升高
        5.4.2 TGF-β1促進(jìn)Control-VSMCs線粒體活性氧產(chǎn)生
        5.4.3 TGF-β1通過(guò)ROS/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)VSMCs衰老
    5.5 實(shí)驗(yàn)討論
    5.6 本章小結(jié)
結(jié)論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間成果
致謝



本文編號(hào)：3199641