目的:通過二代高通量測序技術,對橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis,HT）患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）miRNAs的表達譜進行分析,運用生物信息學方法預測分析,篩選出與HT發(fā)病相關的miRNAs進行驗證,并進一步研究其調(diào)控機制;探討miRNA作為HT潛在生物標志物可能性,為HT的臨床診治提供新思路。方法:1、運用二代高通量測序技術分別檢測5例HT患者和5例健康志愿者PBMCs中的RNA并構(gòu)建測序文庫,利用生物信息學進行計算分析得出,獲得miRNAs差異表達譜。2、從miRNAs的表達譜中挑選出與HT發(fā)病機制可能相關且具有一定研究價值的六個miRNAs,擴大樣本量,通過實時熒光定量PCR（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）技術驗證測序結(jié)果。3、運用基因本體論（Gene Ontology,GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Geno... 

【文章來源】：江蘇大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
主要英文縮略詞
第一章 緒論
    1.1 橋本甲狀腺炎
        1.1.1 橋本甲狀腺炎簡介
        1.1.2 橋本甲狀腺炎的發(fā)病機制
    1.2 Th1 細胞
        1.2.1 Th細胞分類
        1.2.2 Th1 細胞的分化與功能
        1.2.3 Th1 細胞與自身免疫性疾病
    1.3 miRNA
        1.3.1 miRNA的合成及生物學功能
        1.3.2 miRNA與免疫系統(tǒng)
        1.3.3 miRNA與自身免疫性疾病
    1.4 高通量測序
    1.5 本研究的目的、方法、實驗設計及意義
        1.5.1 研究目的
        1.5.2 研究方法
        1.5.3 實驗設計
        1.5.4 研究意義
第二章 橋本甲狀腺炎與健康對照組之間差異表達的miRNA表達譜的構(gòu)建與分析
    2.1 實驗材料及儀器
        2.1.1 研究對象
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 材料和試劑
        2.1.4 主要溶液配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 人外周血單個核細胞分離
        2.2.2 PBMCs中的總RNA的提取
        2.2.3 RNA質(zhì)量檢測及RNA文庫質(zhì)控
        2.2.4 miRNA測序文庫及測序
        2.2.5 miRNA高通量測序及數(shù)據(jù)分析
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 RNA樣本質(zhì)控結(jié)果
        2.3.2 高通量測序結(jié)果
    2.4 討論
第三章 HT患者與健康志愿者中差異表達的miRNAs的表達驗證
    3.1 實驗材料及儀器
        3.1.1 研究對象
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 主要試劑及材料
        3.1.4 試劑配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 分離外周血單個核細胞
        3.2.2 qRT-PCR檢測PBMC中 miRNAs的表達
        3.2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 HT患者與健康志愿者之間差異表達miRNAs
        3.3.2 qRT-PCR檢測差異表達的miRNAs在 PBMCs中相對表達量
    3.4 討論
第四章 HT患者與健康志愿者之間差異表達的miRNAs的生物學功能研究的預測
    4.1 實驗方法
    4.2 實驗結(jié)果
        4.2.1 HT患者中差異表達的miRNAs的靶基因的GO分析
        4.2.2 HT患者中差異表達的miRNAs靶基因的KEGG Pathway分析
    4.3 討論
第五章 橋本甲狀腺炎患者miR-125a-5p作用機制的研究
    5.1 實驗材料及儀器
        5.1.1 研究對象
        5.1.2 miRNAs靶向關系預測軟件
        5.1.3 細胞株及菌種
        5.1.4 主要儀器
        5.1.5 主要試劑及材料
        5.1.6 主要溶液配制
    5.2 實驗方法
        5.2.1 預測和篩選miRNAs的調(diào)控的靶基因
        5.2.2 分離外周血單個核細胞
        5.2.3 FCM檢測Th1 細胞亞群
        5.2.4 qRT-PCR檢測PBMC中 MAF、IFNG的表達
        5.2.5 分選人外周血PBMCs中的CD4+細胞
        5.2.6 細胞轉(zhuǎn)染
        5.2.7 熒光素酶報告載體的構(gòu)建
        5.2.8 Dual-Luciferase報告基因檢測
        5.2.9 qRT-PCR檢測甲狀腺組織中miR-125a-5p、IFNG、MAF的表達水平
        5.2.10 血清中TgAb、TPOAb的檢測
        5.2.11 統(tǒng)計學分析
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 miRNAs靶基因的預測
        5.3.2 HT組與健康對照組外周血PBMC中的MAF表達情況
        5.3.3 雙熒光素酶報告分析miR-125a-5p與 MAF的相互作用
        5.3.4 外周血PBMCs中 miR-125a-5p對 MAF的調(diào)控作用
        5.3.5 HT患者與健康志愿者PBMCs中 Th1 細胞比例變化
        5.3.6 HT患者與健康志愿者PBMCs中 IFNG mRNA相對表達量
        5.3.7 HT患者PBMCs中 miR-125a-5p表達水平與Th1 細胞比例及相關因子相關性分析
        5.3.8 健康志愿者外周血CD4+細胞中miR-125a-5p對 Th1 細胞的調(diào)控作用
        5.3.9 HT患者中miR-125a-5p與甲狀腺自身抗體的關系
        5.3.10 局部甲狀腺組織標本中miR-125a-5p、MAF及 IFNG表達情況
        5.3.11 miR-125a-5p在 HT中的潛在診斷價值
    5.4 討論
結(jié)論
參考文獻
致謝
碩士期間發(fā)表論文



本文編號：3191028