人促甲狀腺激素受體A亞基（TSHR A）在促甲狀腺素受體抗體（TRAb）的產(chǎn)生、Graves病患者血清中促甲狀腺素受體抗體（TRAb）的檢測、Graves病可能的免疫治療等方面均有重要意義。鑒于天然TSHR A亞基無法獲得,真核體系表達所獲得的融合蛋白產(chǎn)量甚微。獲取充分TSHR蛋白A亞基成為Graves病診治和研究的熱點、難點,為此,本研究采用分子生物學技術,試圖建立TSHR A亞基的原核表達體系,在大腸桿菌表達和獲取TSHR A亞基片段。目的構建人促甲狀腺激素受體（TSHR）A亞基的原核表達載體pET102/D-TOPO/TSHR A,在大腸桿菌中表達并分析其免疫活性。方法采用聚合酶鏈式反應擴增TSHR A基因編碼序列,定向連接到載體pET102/D-TOPO中,經(jīng)聚合酶鏈式反應、酶切、測序鑒定后轉化大腸桿菌BL21Star^TM（DE3）;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達TSHR A融合蛋白,超聲裂解細菌,SDS-PAGE、Western-Blot對其進行鑒定,在變性、復性、鎳柱純化后,目的蛋白與Graves病人血清結合鑒定其免疫活性。結果成功構... 

【文章來源】：蘭州大學甘肅省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

TSHRA、B亞基結構示意圖

蘭州大學碩士研究生學位論文人促甲狀腺激素受體A亞基在大腸桿菌中的表達及免疫活性分析12圖2Pet102/D-TOPO原核表達質(zhì)粒圖譜2.1.2主要試劑PrimeSTARHSDNAPlomerase，寶生物工程（大連）有限公司dNTP，寶生物工程（大連）有限公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司質(zhì)粒小提試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司限制性內(nèi)切酶SacⅠ酶，寶生物工程（大連）有限公司DNAmarker2000寶生物工程（大連）有限公司（2000，1000，750，500，250，100），卡那霉素，北京索萊寶有限公司氨芐青霉素，北京索萊寶有限公司PBS緩沖液，北京索萊寶有限公司IPTG，北京索萊寶有限公司鹽酸胍，甘肅偉博鑫有限公司Tis-HCI，北京索萊寶有限公司咪唑，北京索萊寶有限公司EDTA北京索萊寶有限公司30%丙烯酰胺，北京索萊寶有限公司1.5MTris-HCL（PH8.8），北京索萊寶有限公司1MTris-HCL（PH6.8），北京索萊寶有限公司10%SDS，北京索萊寶有限公司過硫酸銨，北京索萊寶有限公司TEMED，北京索萊寶有限公司脫脂奶粉，北京索萊寶有限公司

蘭州大學碩士研究生學位論文人促甲狀腺激素受體A亞基在大腸桿菌中的表達及免疫活性分析28增加，所以最佳誘導時間應5h。見圖8、9。0h#，未誘導；1-8h#，為誘導時間1-8小時圖8鼠抗HIS單克隆抗體WesternBlot誘導時間的檢測圖9IPTG誘導時間對蛋白表達量影響的柱狀圖3.6.2IPTG濃度對蛋白表達量的影響鼠抗HIS單克隆抗體WesternBlot結果經(jīng)ImageJ軟件其灰度值的分析及excel軟件柱狀圖分析顯示：TSHRA亞基蛋白在IPTG濃度為0.1mmol/L時已經(jīng)開始表達，表達量隨IPTG濃度增高而逐漸增加，但當IPTG終濃度為0.5mmol/L時，目的蛋白表達量達到峰值,此后再繼續(xù)提高IPTG終濃度，目的蛋白表達量不再有明顯增加，所以最佳IPTG濃度應為0.5mmol/L。見圖10、11。1#：未誘導；2-9#：0.1mmol/L-0.8mmol/LIPTG誘導


本文編號：3009919