骨質疏松癥(OP)是一種嚴重的健康問題,與絕經(jīng)后中老年婦女尤其相關,其特點是骨骼脆性增加和微結構惡化,極易引發(fā)骨折。隨著老齡化進程的加快,OP是一種日益重要的全球性公共衛(wèi)生問題。骨重建是一種骨吸收和骨形成之間的連續(xù)過程,其中,骨吸收取決于破骨細胞(OCs)的活性,而骨形成取決于成骨細胞(OBs)的活性。絕經(jīng)引起的雌激素缺乏導致OCs的形成和活性增強,OCs在骨丟失中起關鍵作用,OCs最終增加絕經(jīng)期OP的風險。因此,抑制OCs的形成和功能,增強OBs的形成和功能是重要的治療策略。目前,有各種藥物可用于治療絕經(jīng)后OP,如雌激素替代療法,雙膦酸鹽和降鈣素等。但是,如果長期服用藥物會帶來較為嚴重的副作用,例如乳腺癌、子宮內膜癌和心血管疾病。因而,長期服用藥物治療OP的安全性引起了極大的擔憂。在OP治療中值得考慮的替代療法是EMF,EMF治療OP具有臨床安全性、有效和非侵入性,在過去幾十年中受到好評。據(jù)報道,臨床上EMF可增加OP患者的骨密度(BMD),在體動物實驗中EMF可減少卵巢摘除(OVX)誘導的OP模型動物的骨丟失,離體細胞實驗中EMF可影響體外細胞的增殖和分化。但是,EMF的功效目前還不確定,有關其發(fā)生機制的闡述眾說紛紜。而且,還存在矛盾的研究結果。這些不同的結果通常歸因于各研究小組搭建使用的EMF平臺不盡相同,由EMF的不同強度,頻率,波形和持續(xù)時間來解釋。這導致人們對EMF治療OP的科學性存有質疑。因此,能否拋開這些眾多復雜的EMF參數(shù)找到一種方式來準確、簡明、直觀地描述EMF,從而提高實驗的可重復性?有報道表明,EMF對OBs的主要影響與時域中EMF的參數(shù)無關,應鼓勵分析擴展到EMF的頻域特性。因此,重點研究EMF頻譜可能有助于探明EMF對OP效應的可能機制。有很好的證據(jù)表明,當EMF的頻率與關鍵離子的回旋頻率相匹配時,會產(chǎn)生共振效應,該效應影響離子通過膜通道的速率進而產(chǎn)生其他系列生物效應。研究人員提出,其物理機制是離子回旋共振(ICR)。根據(jù)ICR理論,經(jīng)本研究計算許多重要的生物相關離子(如Na~+,K~+和Ca~(2+))的共振頻率是離散的頻率點,在1-100Hz之間。除了共振頻率的基頻率之外,當EMF的頻率等于回旋頻率的高次諧波時,也可以產(chǎn)生共振效性。而且,經(jīng)過計算這些高次諧波在100-3,000 Hz。另外,高頻EMF對OBs和OCs有何效果鮮有報道。因此,我們設計了四種不同頻段(1-100 Hz,100-3,000 Hz,3,000-50,000 Hz和1-50,000 Hz)的EMF,其中1-100 Hz和100-3,000Hz被指定為ICR頻段;3,000-50,000 Hz被指定為高頻段;1-50,000 Hz為同時包含ICR頻段和高頻段的混頻段。本研究旨在探討以下四個問題:(1)研制能產(chǎn)生不同頻段EMF的發(fā)生裝置;(2)不同頻段EMF對小鼠MC3T3-E1成骨前體細胞增殖和分化成熟的影響;(3)不同頻段EMF對RANKL誘導小鼠RAW 264.7破骨前體細胞增殖和分化成熟的影響;(4)不同頻段EMF對OVX小鼠OP的影響。第一部分不同頻段EMF發(fā)生裝置的研制目的:以ICR理論為基礎,需研制一款能產(chǎn)生ICR頻段、高頻段以及同時包含ICR頻段和高頻段的混頻段的EMF發(fā)生裝置,進而利用該裝置開展離體和在體實驗研究。方法:利用National Instruments Labview 2012軟件中的均勻白噪聲信號發(fā)生器經(jīng)濾波產(chǎn)生四種不同頻段的EMF數(shù)字信號。將EMF數(shù)字信號經(jīng)多功能數(shù)據(jù)采集卡轉換為模擬信號。接著,功率放大器實現(xiàn)放大EMF模擬信號并驅動亥姆霍茲線圈產(chǎn)生最終所需要的不同頻段EMF。結果:該裝置可同時輸出四種頻段(1-100 Hz,100-3,000 Hz,3,000-50,000 Hz和1-50,000 Hz)的EMF,分別賦予別名:LP,1-100 Hz,低頻;BP,100-3,000 Hz,中頻;HP,3,000-50,000 Hz,高頻;AP,1-50,000 Hz,混頻。四種EMF信號的每個頻譜分量具有相同的能量幅度(-40 dB)。其中1-100 Hz和100-3,000 Hz被指定為ICR頻段,其可產(chǎn)生離子諧振效應。結論:該裝置充分利用了計算機豐富的軟硬資源,具有功能強、性價比高、可擴充性好、操作方便等優(yōu)勢。實驗人員可通過圖形用戶界面操作虛擬儀器面板,極大的方便了實驗研究的開展。第二部分不同頻段EMF對小鼠MC3T3-E1成骨前體細胞增殖和分化成熟的影響目的:本研究旨在探究四種不同頻段EMF對MC3T3-E1成骨前體細胞分化為成骨細胞(OBs)的影響。方法:實驗分為5組:Control(對照),LP,BP,HP以及AP組。LP,BP,HP和AP組分別用四種頻段EMF照射,每天3小時,持續(xù)6天。檢測細胞增殖、分化以及成骨相關基因和蛋白表達。結果:LP,BP和AP促進MC3T3-E1細胞的增殖、堿性磷酸酶(ALP)活性以及與成骨相關的mRNA和蛋白質表達。LP和BP對MC3T3-E1細胞的增殖和分化的促進作用無顯著性差異,而AP對MC3T3-E1細胞的增殖和分化具有比LP和BP更強的促進效果。此外,與Control組相比,LP,BP和AP照射可升高MC3T3-E1細胞內RANKL/OPG mRNA和蛋白質表達的比值,本研究推測由LP,BP和AP引起的MC3T3-E1細胞分化為OBs能力的增強可間接引起破骨細胞(OCs)形成能力的增強。而HP抑制MC3T3-E1細胞的增殖、ALP活性以及與成骨相關的mRNA和蛋白質表達。結論:研究結果表明包含離子ICR頻率的低頻段LP和中頻段BP不僅促進MC3T3-E1細胞分化為OBs,而且可間接促進破骨細胞的形成。不包含ICR頻率的高頻段HP可抑制MC3T3-E1細胞分化為OBs。同時包含ICR頻段與高頻段的混頻段AP具有LP,BP和HP頻段的疊加累積效應,其顯著促進了MC3T3-E1細胞分化為OBs,并且間接促進了由OBs形成能力增強帶來的破骨細胞的形成。第三部分不同頻段EMF對RANKL誘導小鼠RAW 264.7破骨前體細胞增殖和分化的影響目的:本研究旨在探究四種不同頻段EMF對核因子κB受體活化因子配體(RANKL)誘導的RAW 264.7破骨前體細胞分化為破骨細胞(OCs)的影響。方法:實驗分為6組,包括Control,RL,RL+LP,RL+BP,RL+HP和RL+AP。將細胞接種到培養(yǎng)板,待貼壁后,除Control外,其他5組加入50 ng/mL的RANKL誘導RAW 264.7破骨前體細胞分化為OCs。然后,從加入誘導劑的樣品中隨機選擇4組分別照射LP,BP,HP,AP四種不同頻段EMF,每天照射3小時,持續(xù)6天。實驗設計包括五個方面:增殖測定、凋亡測定、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、細胞骨架染色以及破骨相關蛋白質檢測。加干預孵育6天后,由RAW 264.7破骨前體細胞分化的多核細胞被認為是OCs。結果:細胞增殖結果顯示,照射2天后,各組之間細胞增殖沒有差異。照射6天后,Control,RANKL,RANKL+LP以及RANKL+BP組細胞增殖無顯著性差異,LP、BP對RANKL誘導的OCs增殖無影響。HP、AP顯著抑制了RANKL誘導的OCs增殖(P0.01)。四種頻段的EMF照射3天對RANKL誘導的OCs的凋亡沒有影響。細胞凋亡檢測結果顯示,照射6天,LP、BP對RANKL誘導的OCs凋亡沒有影響。HP、AP顯著促進了RANKL誘導的OCs的早期凋亡,對晚期凋亡沒有影響。TRAP染色結果顯示,RANKL能誘導單核RAW 264.7破骨前體細胞分化成為成熟的多核OCs,6天的LP、BP照射對OCs的形成能力沒有影響,HP、AP抑制OCs的形成。細胞骨架染色結果顯示,RANKL誘導形成的OCs骨架分布清晰規(guī)則,并在細胞周圍形成許多絲狀偽足,胞內F-actin熒光較強。LP、BP對OCs骨架沒有影響。HP、AP使細胞骨架皺縮,F-actin熒光較若,有的出現(xiàn)胞核裂解。Western blot結果顯示沒有誘導劑的Control組RANK蛋白不表達。RANKL誘導組中RANK蛋白高表達。與RANKL誘導組相比,LP和BP照射均未改變RANK表達(P0.05),且LP與BP之間無差異。此外,與RANKL誘導組相比,HP和AP顯著降低RANK表達(P0.01),而HP和AP之間沒有差異。結論:RANKL能誘導單核RAW 264.7破骨前體細胞分化成為成熟的多核OCs,LP、BP對RANKL誘導的OCs的增殖無影響、對OCs的形成能力也沒有影響,HP、AP抑制RANKL誘導的OCs增殖,并抑制OCs的形成。第四部分不同頻段EMF對卵巢摘除小鼠骨質疏松的影響目的:本研究旨在探究四種不同頻率的EMF對卵巢摘除(OVX)小鼠骨質疏松癥(OP)的影響。方法:48只3月齡的雌性BALB/c小鼠按體重隨機分為以下6組(n=8):假手術對照組(Sham),卵巢切除組(OVX),OVX+LP照射組,OVX+BP照射組,OVX+HP照射組和OVX+AP照射組。OVX+LP,OVX+BP,OVX+HP和OVX+AP組分別照射于四種不同頻段的EMF中,3 h/d,7 d/wk,持續(xù)8周。每周記錄各組小鼠的體重,8周EMF干預結束時,麻醉后脫頸法處死小鼠。對血清進行生化分析,對右股骨進行生物力學檢查,對左股骨分別進行μCT掃描分析和組織形態(tài)學分析,對右肱骨進行實時熒光定量PCR檢測。結果:骨形成在OVX小鼠中輕微增強,微觀上可通過與假手術組相比,稍微升高的血清骨形成標志物水平(BALP,OCN,OPG和P1NP)和成骨相關基因的表達水平(ALP,BMP-2,COL-1,OCN,OSX,Runx2,Wnt1,β-catenin,LPR5,OPG和RANKL)加以證實。此外,骨吸收在OVX小鼠中顯著增強,骨吸收大于骨形成,微觀上可通過與假手術組相比,顯著升高的血清骨吸收標志物水平(TRAP-5b和CTX-I)和破骨相關基因表達水平(RANK和RANKL/OPG)加以證實。最終,OVX引起的加速的骨重建導致骨量減少,骨微結構和機械強度退化,宏觀上可通過生物力學、μCT和骨的組織形態(tài)學特征加以證實。與OVX相比,LP和BP顯著增加血清骨形成標志物和成骨相關基因表達。此外與OVX相比,LP和BP照射可使OVX小鼠骨內RANKL/OPG mRNA比值升高,本研究推測由LP和AP引起的OBs骨形成活性的增強可間接引起OCs骨吸收活性的增強。因而,LP,BP對OVX誘導的OP小鼠中降低的骨量和退化的骨微結構和機械強度的效果有限。與OVX相比,HP顯著同時降低了血清骨形成和骨吸收標志物以及成骨和破骨細胞相關的基因表達。因而,HP對OVX誘導的OP小鼠中降低的骨量和退化的骨微結構和機械強度的效果仍然不佳。AP具有LP,BP和HP的累積效應,與OVX相比,其顯著增加骨形成并降低骨吸收,最終可降低OVX誘導的OP小鼠的骨丟失。結論:OVX導致小鼠骨量減少和骨微結構和機械強度的退化,并且這種狀況不被LP,BP和HP照射而改變。然而,AP通過促進骨形成和抑制骨吸收降低OVX引起的小鼠骨量的減少和骨微結構和機械強度的退化。骨質量反映了骨形成和骨吸收的平衡狀態(tài),其在細胞水平涉及OBs和OCs的協(xié)調性生長。ICR頻段相關的EMF對OBs有積極影響,高頻EMF對OBs和OCs有副作用。合理結合不同頻段對成骨和破骨的作用,是治療OP的關鍵�？偨Y本文以“離子回旋共振假說”的探索和驗證為主線,采用“工學-醫(yī)學、微觀-宏觀、在體-離體”相結合的實驗方案,開展了不同頻段EMF對OVX小鼠OP的影響及其機理的體內外實驗研究,研究結果發(fā)現(xiàn):(1)ICR頻段相關的EMF顯著促進骨形成活性,并間接促進骨吸收活性。然而,OVX誘導的OP小鼠中骨吸收仍占主導地位,因而LP,BP對OVX誘導的OP小鼠中降低的骨量和退化的骨微結構和機械強度的效果有限。(2)高頻段不僅急劇降低骨形成活性,而且顯著降低骨吸收活性。因而,HP對OVX誘導的OP小鼠中降低的骨量和退化的骨微結構和機械強度的效果也不佳。(3)均包含ICR頻段與高頻段的AP既可顯著促進骨形成活性又可顯著降低骨吸收活性,最終可降低OVX誘導的OP小鼠的骨丟失。(4)ICR頻段相關的EMF對OBs有積極影響,高頻EMF對OBs和OCs有副作用。合理結合不同頻段對成骨和破骨的作用,是治療OP的關鍵。本研究主要研究創(chuàng)新點如下:(1)設計了可用于骨研究的基于白噪聲頻域特征的EMF方法,并篩選了EMF實驗參數(shù)。(2)系統(tǒng)驗證了不同頻段EMF對成骨和破骨的效應,為揭示EMF對骨的非熱生物效應作用機理提供了新的思路與實驗依據(jù)。(3)動物實驗表明本論文提出的EMF方法能夠較好的改善去勢小鼠的OP。
【學位單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R580
【部分圖文】：
整體實驗方案
基質細胞位于骨髓，并在骨髓環(huán)境中的分化因子的作用下分化為脂肪或軟骨。骨細胞是已成功完成骨形成并被嵌入骨基質內的成骨細胞。雖然這些最初被認為是惰性的，但是近期的一些研究表明骨細胞能與靜息表面成骨細胞（細胞）連通，并在適當?shù)那闆r下（例如，微裂紋，重力或流體剪切力），它們可發(fā)骨重建。微小管連接成骨細胞與骨細胞，并負責骨細胞響應重力信號[11]。如圖 2 所示，當骨細胞被局部因子和系統(tǒng)調節(jié)劑例如甲狀旁腺激素（PTH）、胞介素以及雌激素激活時，骨重建開始。骨髓基質細胞（成骨前體細胞）合成放兩種細胞因子：巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和 NF-κB 配體的受體激活RANKL），這兩種細胞因子可以促進破骨細胞的產(chǎn)生和分化。骨髓基質細胞（前體細胞）引起骨吸收，并且在骨基質的吸收過程中會釋放生長因子如轉化生子 β（TGFβ），以生成更多的成骨細胞[12]。這導致一種偶聯(lián)的骨重建順序：骨髓細胞合成的 M-CSF 和 RANKL 引起骨吸收，接著骨基質的吸收過程中會釋放生子 TGFβ 促進骨形成。
骨細胞譜系的分化過程，以及經(jīng)典 Wnts 在調節(jié)這些過程中的中心源自多能中胚層或神經(jīng)嵴祖細胞。通過 β-聯(lián)蛋白穩(wěn)定化的經(jīng)典 Wnt 軟骨形成。Wnt10B 阻止脂肪形成。經(jīng)典 Wnt 通路促進成骨細胞譜存活并誘導前成骨細胞的增殖。ALP，堿性磷酸酶；COLA1，α-1 ；DMP1，牙本質基質蛋白 1；OCN，骨鈣素；OSX，具有鋅指結異性轉錄因子 osterix；PTHR，甲狀旁腺激素受體；RANKL，NF-κ活劑；Runx2，runt 相關轉錄因子 2； SOST，硬骨素。steoblast lineage specification, expansion and terminal differentiatioentral role of canonical Wnts in regulating these processes. Osteob from multipotent mesodermal or neural crest progenitors. Activatial Wnt pathway through β-catenin stabilization prevents chondr prevents adipogenesis. The canonical Wnt pathway promotes surv
【相似文獻】
相關期刊論文 前10條
1 周晶瑩;周寧;張祎雯;楊弘光;趙英俠;;中藥及針刺對去卵巢骨質疏松大鼠OPG/RANK/RANKL調節(jié)作用的實驗研究概況[J];中國醫(yī)藥導報;2018年33期
2 宮青;趙洪芹;;血清OPG/RANKL比例與腦梗死病因亞型關系的研究[J];中外女性健康研究;2018年18期
3 范寶婷;徐偉峰;沈佩;李慧萍;趙華強;張善勇;;RANKL在顳下頜關節(jié)軟骨退變中的作用[J];中國口腔頜面外科雜志;2017年02期
4 李琳娟;彭娟敏;梁曉;康娜;;DMSO對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL的研究[J];全科口腔醫(yī)學電子雜志;2016年15期
5 李鋒;李寰;沙鑫;楊衛(wèi)周;馬文瑞;陶惠人;;非天然氨基酸突變的小鼠RANKL蛋白原核表達及抗血清制備[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2015年03期
6 Taishin Akiyama;Miho Shinzawa;Nobuko Akiyama;;RANKL-RANK interaction in immune regulatory systems[J];World Journal of Orthopedics;2012年09期
7 Hong-Juan Chang;Tian-Fa Li;Jun-Li Guo;You-Ling Lan;Yue-Qiong Kong;Xin Meng;Xian-Ji Ma;Xiao-Ling Lu;Wei-Ying Lu;Shao-Jiang Zheng;;Effects of high glucose on expression of OPG and RANKL in rat aortic vascular smooth muscle cells[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2015年03期
8 梁宗挺;龐宇舟;陳筱悅;唐靜;;RANK/RANKL/OPG信號通路與類風濕性關節(jié)的研究進展[J];現(xiàn)代養(yǎng)生;2017年10期
9 陶可;曾暉;肖德明;熊奡;翁鑒;康斌;;Influences of IL-6R Antibody on PMMA Bone Cement-mediated Expression of OPG and RANKL in Synovial Fibroblasts[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2014年02期
10 王琳源;林曉萍;;RANKL在牙周炎骨吸收中的研究進展[J];口腔醫(yī)學;2013年07期
相關博士學位論文 前10條
1 雷濤;不同頻段電磁場對卵巢摘除小鼠骨質疏松影響的體內外實驗研究[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學;2018年
2 曾克勤;IgG型免疫復合物以RANKL非依賴性方式快速誘導人單核細胞向破骨細胞分化的實驗研究[D];蘇州大學;2018年
3 胡明;慢性中耳炎骨重塑影響因素的研究[D];天津醫(yī)科大學;2016年
4 牛紅青;基于JAK2/STAT3和p38MAPK信號通路探討環(huán)磷酰胺聯(lián)合甲氨蝶呤抑制類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞RANKL表達的研究[D];山西醫(yī)科大學;2018年
5 戴先文;1.不同干預措施對廢用性骨質疏松治療的實驗和臨床研究 2.RNAi法特異性抑制RANKL的表達[D];第四軍醫(yī)大學;2004年
6 孫海燕;體外培養(yǎng)人牙囊細胞中OPG和RANKL的表達及其對牙齒萌出的作用[D];第四軍醫(yī)大學;2006年
7 田慶顯;1，25（OH）_2VD_3、降鈣素對小鼠成骨細胞和軟骨細胞增殖及OPG/RANKL/RANK表達影響的實驗研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2004年
8 王春紅;氟對骨髓基質細胞及其產(chǎn)物OPG、RANKL和相關細胞因子的影響[D];吉林大學;2006年
9 劉幼碩;脂聯(lián)素調節(jié)成骨細胞OPG/RANKL的表達和TIMP-3誘導成骨細胞凋亡[D];中南大學;2007年
10 任嬡姝;應力刺激下成牙骨質細胞OPG/RANKL的表達及其信號轉導通路的研究[D];四川大學;2007年
相關碩士學位論文 前10條
1 韋頌觀;RNAi技術沉默OPG基因對骨髓間充質干細胞RANKL、OPG表達變化研究[D];廣西醫(yī)科大學;2018年
2 陳慧鴻;RANKL基因轉染對骨髓間充質干細胞RANKL、OPG表達影響研究[D];廣西醫(yī)科大學;2018年
3 韓兵;淫羊藿苷調節(jié)OPG和RANKL蛋白表達對大鼠骨質疏松骨折愈合的影響[D];安徽醫(yī)科大學;2018年
4 張振;穗花杉雙黃酮對RANKL誘導破骨細胞生成及鈦顆粒誘導的小鼠顱骨骨溶解的作用探究[D];大連醫(yī)科大學;2018年
5 李玉星;基于OPG和RANKL探討六味地黃湯及其“補瀉”藥對干預絕經(jīng)后骨質疏松模型大鼠的作用及其機制[D];湖南中醫(yī)藥大學;2018年
6 王雯雯;PMPs對類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞中RANKL/OPG系統(tǒng)的影響[D];揚州大學;2018年
7 黨鵬宇;人臍帶間充質干細胞微泡干預對膠原誘導關節(jié)炎大鼠骨代謝失衡的調節(jié)機制的研究[D];山西醫(yī)科大學;2018年
8 張鑫;低濃度二甲基亞砜對RANKL誘導的RAW264.7細胞破骨分化影響的體外研究[D];華北理工大學;2018年
9 徐邢環(huán)宇;~(99m)Tc-MDP對頜骨成釉細胞瘤中OPG、RANK和RANKL表達影響的研究[D];昆明醫(yī)科大學;2018年
10 羅斌;高糖環(huán)境對RAW264.7細胞增殖及RANKL誘導破骨細胞分化的影響[D];南昌大學;2016年
本文編號：
2871626
