發(fā)布時(shí)間：2020-09-28 09:51

　　 目的:研究在2型糖尿病(dbdb)小鼠模型中,骨髓高表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子neuritin對外周神經(jīng)病變的影響及其作用機(jī)制。方法:1.構(gòu)建骨髓特異性高表達(dá)neuritin的轉(zhuǎn)基因小鼠,用構(gòu)建的高表達(dá)neuritin與db/m雜合子雜交獲得高表達(dá)neuritin的2型糖尿病小鼠;將實(shí)驗(yàn)分為8組:(1)正常對照組(db/m)小鼠(2)2型糖尿病組(TD2)小鼠(3)2型糖尿病+二甲雙胍組(TD2+MET)小鼠(4)高表達(dá)neuritin+2型糖尿病組(A/Lyz-Cre+TD2)小鼠(5)高表達(dá)neuritin+2型糖尿病+二甲雙胍組(A/Lyz-Cre+TD2+MET)小鼠(6)高表達(dá)neuritin+db/m小鼠組(A/Lyz-Cre+db/m)小鼠,從第10周鼠齡開始喂藥,連續(xù)給藥8周,每周測1次體重,每兩周測1次空腹血糖。2.喂藥結(jié)束后,對各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)傳導(dǎo)檢測,觀察小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量;用ELISA對各組小鼠骨髓上清、血漿、坐骨神經(jīng)上清的SDF-1進(jìn)行檢測。3.用HE和油紅O染色,檢測各組小鼠骨髓病理結(jié)構(gòu)和脂肪堆積;用激光共聚焦結(jié)合免疫熒光組織化學(xué)檢測各組小鼠骨髓神經(jīng)密度(TH)、微血管密度(CD31)、骨髓neuritin的表達(dá)。4.用透射電鏡檢測各組小鼠坐骨神經(jīng)病理的結(jié)構(gòu),用激光共聚焦結(jié)合免疫熒光組織化學(xué)檢測各組小鼠坐骨神經(jīng)的神經(jīng)元再生(GAP43)、神經(jīng)纖維密度(NF200)、神經(jīng)髓鞘化(GFAP)、雪旺細(xì)胞的增殖(S100+Brdu)。5.采用骨髓提原代BMSC進(jìn)行體外遷移實(shí)驗(yàn),檢測SDF-1α,AMD3100(CXCR4抑制劑)、Ly294002(Pakt抑制劑)對BMSC遷移的影響,以及觀察2型糖尿病狀和2型糖尿病骨髓高表達(dá)neuritin狀態(tài)下BMSC遷移的變化;用激光共聚焦結(jié)合免疫熒光組織化學(xué)檢測骨髓CXCR4、SDF-1α的表達(dá)以及坐骨神經(jīng)Pakt的表達(dá)。結(jié)果:1.TD2小鼠的MNCV和SNCV顯著低于db/m小鼠(P0.05),治療組小鼠(A/Lyz-Cre+TD2小鼠、A/Lyz-Cre+TD2+MET小鼠、TD2+MET小鼠)的MNCV和SNCV有明顯改善(P0.05)。2.治療組小鼠在經(jīng)過8周研究治療時(shí)出現(xiàn)血糖進(jìn)展減緩,喂藥結(jié)束后血糖顯著低于TD2小鼠(P0.05);且相較于TD2小鼠,2型糖尿病骨髓高表達(dá)neuritin模型(A/Lyz-Cre+TD2小鼠、A/Lyz-Cre+TD2+MET小鼠)的體重明顯減輕(P0.05),而TD2+MET小鼠體重?zé)o明顯變化;治療組小鼠的血清TC、LDL-C含量低于TD2小鼠但不具有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05),而它們的TG含量低于TD2小鼠且差異顯著(P0.05);對于HDL-C,2型糖尿病骨髓高表達(dá)neuritin模型顯著高于TD2小鼠(P0.05),而TD2+MET小鼠只略高于TD2小鼠但不具有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)。3.股骨HE染色表明:相較于TD2小鼠,治療組小鼠的細(xì)胞密度明顯改善,且均低于db/m小鼠和A/Lyz-Cre+db/m小鼠(P0.05);油紅O染色表明:治療組小鼠的油紅O陽性率與TD2小鼠相比無顯著差異(P0.05),且均顯著高于db/m小鼠和A/Lyz-Cre+db/m小鼠(P0.05);4.股骨免疫熒光染色表明:與db/m小鼠、A/Lyz-Cre+db/m小鼠相比,TD2小鼠骨髓CD31陽性面積和骨髓TH陽性率大大降低(P_(CD31)0.001,P_(TH)0.05),而治療組相較于TD2小鼠,其骨髓CD31陽性面積和骨髓TH陽性率有明顯提高(P_(CD31)0.05,P_(TH)0.05)。5.在透射電鏡下TD2小鼠的坐骨神經(jīng)表現(xiàn)為線粒體脊消失、線粒體外膜腫脹、神經(jīng)軸索膜與髓鞘膜分離、髓鞘板層結(jié)構(gòu)消失的癥狀,MET治療后其病理癥狀有輕微程度減輕,而2型糖尿病骨髓高表達(dá)neuritin模型的以上癥狀有明顯改善;坐骨神經(jīng)免疫熒光染色表明:TD2小鼠、TD2+MET小鼠的坐骨神經(jīng)GAP43表達(dá)量顯著低于骨髓高表達(dá)neuritin模型(A/Lyz-Cre+db/m小鼠、A/Lyz-Cre+TD2小鼠和A/Lyz-Cre+TD2+MET小鼠)(P0.01);TD2小鼠相較于db/m小鼠、A/Lyz-Cre+db/m小鼠坐骨神經(jīng)施旺細(xì)胞的增殖速率(Brdu+S100)顯著降低(P0.05),2型糖尿病骨髓高表達(dá)neuritin模型相較于TD2小鼠坐骨神經(jīng)施旺細(xì)胞的增殖速率明顯改善(P0.01);TD2小鼠、TD2+MET小鼠坐骨神經(jīng)GFAP分布區(qū)域遠(yuǎn)低于db/m小鼠(P0.05),2型糖尿病骨髓高表達(dá)neuritin模型比TD2小鼠坐骨神經(jīng)GFAP分布顯著增多(P0.01)。而各模型鼠間坐骨神經(jīng)NF200表達(dá)量無顯著性差異。6.BMSC體外遷移結(jié)果顯示:SDF-1α確實(shí)能夠增強(qiáng)BMSC的遷移,并且是沿著SDF-1α濃度梯度方向遷移的,當(dāng)用CXCR4抑制劑(AMD3100)和Pakt抑制劑(Ly94002)處理后,BMSC的遷移能力顯著降低;TD2小鼠的BMSC遷移率顯著低于db/m小鼠,而在2型糖尿病狀態(tài)下骨髓高表達(dá)neuritin有助于BMSC的遷移;ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:2型糖尿病狀態(tài)下坐骨神經(jīng)的SDF-1α濃度明顯增高,而在骨髓高表達(dá)neuritin的模型鼠中(A/Lyz-Cre+TD2小鼠、A/Lyz-Cre+TD2+MET小鼠)SDF-1α濃度按骨髓-血漿-坐骨神經(jīng)梯度分布率更明顯;通過股骨切片的SDF-1α+CXCR4免疫熒光染色顯示:在2型糖尿病狀態(tài)下(包括2型糖尿病骨髓高表達(dá)neuritin的模型鼠)小鼠骨髓的SDF-1α與CXCR4有共定位;通過坐骨神經(jīng)切片的GFAP+Pakt免疫熒光染色顯示:2型糖尿病狀態(tài)下小鼠坐骨神經(jīng)髓鞘受到損傷會激活Pakt,而骨髓高表達(dá)neuritin也會促進(jìn)Pakt的激活。結(jié)論:1.骨髓神經(jīng)neuritin能修復(fù)2型糖尿病骨髓神經(jīng)病變,改善骨髓功能。2.骨髓神經(jīng)neuritin能提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力。3.骨髓神經(jīng)neuritin修復(fù)2型糖尿病外周神經(jīng)病變是通過SDF-1α/CXCR4軸激活PI3K/Akt通路來實(shí)現(xiàn)的,推測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與其中發(fā)揮著重要的修復(fù)作用。
【學(xué)位單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2
【部分圖文】：

西 南 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文46圖4 各組小鼠骨髓細(xì)胞密度和脂肪體積比較。（A）各組小鼠股骨HE染色（100×）左圖顯示典型區(qū)域放大（400×）； （B）各組小鼠股骨油紅O染色（400×）（C）對各組小鼠股骨細(xì)胞密度的定量分析；（D）對各組小鼠股骨油紅O陽性區(qū)域面積的定量分析；與正常組相比**P <0.01，與2型糖尿病組相比##P <0.05。Figure 4 The comparison of bone marrow cell density and fat volume of mouse in eachgroup. (A)The femur HE staining (100 ×), the left shows the typical area magnification (400×). (B) The femur with oil red O staining (400 ×). (C) Quantitative of cell density of femur.(D) Quantitative of positive area of the femur with oil red O .**P <0.01vs control group,##P<0.05 vs type 2 diabetes group.5.2 小鼠骨髓微血管病變 與正常對照db/m小鼠組和高表達(dá)neuritin+db/m小鼠組相比，2型糖尿病組小鼠骨髓CD31陽性面積大大降低，即累積的血管密度顯著性減少（P<0.001）；對于治療組（高表達(dá)neuritin+2型糖尿病組、高表達(dá)neuritin+2型糖尿病+二甲雙胍、2型糖尿病+二甲雙胍組），骨髓CD31陽性面積有明顯提高，提示其骨髓的血管密度大于2型糖尿�。≒<0.05）(見圖5A，5B)。5.3 小鼠骨髓交感神經(jīng)病變 用交感神經(jīng)纖維抗體：兒茶酚胺酶酪氨酸羥化酶（TH）染色骨髓，來評估各組小鼠交感神經(jīng)病變情況。與正常對照db/m

西 南 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文48圖5 各組模型鼠骨髓微血管病變程度和交感神經(jīng)病變程度的比較。（A）激光共聚焦IF圖片顯示各組小鼠股骨的CD31（紅）、TH（綠）、核（DAPI）染色率，比列尺：50mm；（B）對各組小鼠股骨CD31陽性區(qū)域的定量分析；（C）對各組小鼠股骨TH陽性的區(qū)域定量分析；與正常組相比**P <0.01，與2型糖尿病組相比##P <0.01。IF：免疫熒光。Figure 5. The comparison of the degree of microvascular lesions and sympatheticneuropathy in the bone marrow in each group. (A) Representative examples of highmagnification confocal IF images showing staining of CD31 (red), TH (green), nuclear(DAPI) in bone marrow in each group. Scale bar: 50 mm. (B) Quantitative of positive regionof CD31 red of femur. (C) Quantitative of positive region of TH green of femur.**P <0.01vscontrol group,##P <0.05 vs type 2 diabetes group.5.4 表達(dá)CXCR4-骨髓細(xì)胞的遷移與SDF-1的濃度水平密切相關(guān)前研究表明，在疾病條件下CXCR-4/SDF-1介導(dǎo)細(xì)胞的遷移與受損組織高度相關(guān)[47.48]，因此，我們檢測在骨髓中是否CXCR4-細(xì)胞（CXCR4表達(dá)的細(xì)胞）與SDF-1相關(guān)。通過SDF-1α和CXCR4的IF染色，結(jié)果表明在2型糖尿病小鼠骨髓中，CXCR4-細(xì)胞的分布與SDF-1α高度相關(guān)，并且部分免疫反應(yīng)顯示CXCR4與SDF-1α存在共定位（見圖6）。我們進(jìn)一步確認(rèn)SDF-1的免疫活性處在細(xì)胞

圖6 2型糖尿病可以誘導(dǎo)骨髓SDF-1增強(qiáng)CXCR4陽性細(xì)胞的動員。激光共聚焦IF圖片顯示各組小鼠股骨的CXCR4（紅）、SDF-1α（綠）、核（DAPI）染色，比列尺：50mm。Figure 6. Type 2 diabetes can induced SDF-1 elevation recruits CXCR4-positive cells inbone marrow. Representative examples of high magnification confocal IF images showingstaining of CXCR4 (red), SDF-1(green), nuclear (DAPI) in bone marrow in Control , in T2DA/Lyz-Cre+T2D. Scale bar: 50 mm.6 小鼠骨髓neuritin表達(dá)通過免疫熒光檢測各組小鼠骨髓neuritin的表達(dá)量。相比于正常對照db/m小鼠，2型糖尿病組小鼠的neuritin表達(dá)量顯著降低, 高表達(dá)neuritin+db/m小鼠組的neuritin表達(dá)量顯著（P<0.05）；高表達(dá)neuritin+2型糖

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