發(fā)布時間：2020-09-22 19:20

　　 胰島是胰腺的內(nèi)分泌腺,其主要作用是感受體內(nèi)的血糖水平并對其進(jìn)行調(diào)節(jié)。胰島在形態(tài)上是許多大小不等、形狀不同的細(xì)胞團(tuán)。其中主要的細(xì)胞類型包括α、β、δ、pp和ε等5種細(xì)胞。當(dāng)人體內(nèi)的血糖水平降低的情況下,比如在饑餓的狀態(tài)下,胰島α細(xì)胞會分泌胰高血糖素來促進(jìn)體內(nèi)的血糖水平升高。相反,如果當(dāng)體內(nèi)血糖水平升高的時候,胰島β細(xì)胞會分泌胰島素(Insulin,Ins)來降低體內(nèi)的血糖水平。而δ細(xì)胞主要分泌生長抑素(Somatostatin,Sst),并以負(fù)反饋?zhàn)饔玫姆绞接绊懄良?xì)胞和β細(xì)胞的激素分泌,從而形成一個精準(zhǔn)的細(xì)胞調(diào)節(jié)環(huán)路。最近的研究表明,δ細(xì)胞作為胰島細(xì)胞環(huán)路的一個重要組成部分,其功能的穩(wěn)定對于維持血糖平衡非常重要。然而,胰島δ細(xì)胞的功能在胰島環(huán)路中的精確調(diào)控機(jī)制尚不清楚。CULLIN-RING連接酶復(fù)合物(CRLs)是目前研究發(fā)現(xiàn)已知的哺乳動物體內(nèi)種類最多的一類E3泛素連接酶復(fù)合物,可以通過對底物進(jìn)行泛素化修飾,從而改變蛋白功能或促進(jìn)被修飾蛋白的降解,Cullin家族成員在此泛素連接酶復(fù)合物中起到支架蛋白的作用。哺乳動物共有8個Cullin家族成員,其中Cullin 4A(CUL4A)和Cullin4B(CUL4B)同源性很高,也有著許多相類似的生物學(xué)功能。不同的是,CUL4B的N端具有核定位序列,除了和CUL4A一樣在細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮作用外,還可以定位于細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能。Cullin 4通過與DDB1和RBX1形成E3連接酶復(fù)合物(CRL4B或CRL4A),這些復(fù)合物在多種生命活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。重要的是,CUL4B喪失功能突變患者表現(xiàn)為向心性肥胖。已有的研究表明,Cullin蛋白家族成員在胰島功能和糖脂代謝中有著重要的調(diào)控作用。然而,CUL4B在胰島細(xì)胞中的功能與作用目前尚未有研究報導(dǎo)。本研究中我們利用Cre-Loxp重組酶系統(tǒng),將Ins2-Cre小鼠或Sst-Cre小鼠與Cul4bfl/fl小鼠進(jìn)行交配,得到了分別在胰島β細(xì)胞或胰島δ細(xì)胞中特異性敲除Cul4b的兩種小鼠模型。隨后我們檢測了兩種敲除小鼠的葡萄糖代謝中的相關(guān)指標(biāo),發(fā)現(xiàn)只有δ細(xì)胞中特異性敲除Cul4b的小鼠,表現(xiàn)出糖代謝受損。其基礎(chǔ)血糖值與對照小鼠相比沒有顯著差異,但是餐后血糖水平顯著升高。同時葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)(Glucose tolerance test,GTT)表明該小鼠出現(xiàn)葡萄糖不耐受的現(xiàn)象。進(jìn)一步,我們分離出組織特異性Cul4b敲除小鼠的胰島進(jìn)行實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在胰島δ細(xì)胞中特異性敲除Cul4b后,其由葡萄糖引起的胰島激素分泌水平與對照組相比有著明顯差異,具體表現(xiàn)為葡萄糖引起的胰島δ細(xì)胞特異敲除小鼠的胰島素分泌水平與對照小鼠相比顯著降低,生長抑素分泌顯著升高。結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)在δ細(xì)胞中Cul4b缺失導(dǎo)致生長抑素分泌增加的這一過程中,L型鈣通道Cav1.2和腺苷酸環(huán)化酶AC6發(fā)揮重要作用。我們進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),在胰島δ細(xì)胞中,CRL4B-PRC2復(fù)合物通過和胰島δ細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子HHEX相互作用,表觀遺傳調(diào)控Cav1.2和AC6的表達(dá)水平,從而調(diào)節(jié)生長抑素的分泌。并且長時程的高糖或者旁分泌因子UCN3可以通過調(diào)控CUL4B和EZH2的表達(dá),引起L型鈣通道Cav1.2和腺苷酸環(huán)化酶AC6的表達(dá)變化,最終在胰島穩(wěn)態(tài)和血糖調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用;同時,在人的胰島δ細(xì)胞中,也驗(yàn)證了 CUL4B表達(dá)下調(diào)或活力降低會促進(jìn)生長抑素的分泌。研究目的本研究的目的是通過構(gòu)建分別在胰島β細(xì)胞或δ細(xì)胞中特異性敲除Cul4b的小鼠模型,來研究CUL4B在胰島細(xì)胞中的具體功能與作用。并結(jié)合多種基因工具小鼠,應(yīng)用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),細(xì)胞生物學(xué),生物化學(xué)等多種手段,研究CUL4B對胰島穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用及其分子機(jī)制,以及在各種生理刺激條件下CUL4B的功能和相關(guān)的作用機(jī)制。研究方法1.Cl4b條件敲除小鼠的獲得與鑒定Ins2-Cre+/-Culbfl/Y(胰島β細(xì)胞中特異性敲除Cul4b)小鼠和對照小鼠是由Ins2-Cre+/-小鼠和Cul4bfl/fl小鼠交配得到的;而Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y(胰島δ細(xì)胞中特異性敲除Cul4b)小鼠和對照小鼠是由Sst-Cre+/-小鼠和Cul4bfl/fl小鼠交配得到的。在小鼠出生后的3周或4周的時候剪鼠尾,用相關(guān)試劑盒提取小鼠基因組DNA,并使用對應(yīng)的引物進(jìn)行PCR,依據(jù)最終PCR產(chǎn)物的分子量來鑒定其小鼠基因型。2.檢測敲除小鼠的糖代謝水平以及葡萄糖耐量用Ins2-Cre+/-Cul4bfl/Y小鼠或Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將得到的敲除小鼠和對照小鼠進(jìn)行禁食不禁水饑餓16小時之后,測量這些小鼠的基礎(chǔ)血糖值并進(jìn)行記錄。然后重新喂食2小時,再次測量血糖值并記錄,將兩種敲除小鼠的糖代謝水平分別與對照小鼠進(jìn)行比較。類似的,將敲除小鼠和對照小鼠進(jìn)行禁食不禁水饑餓16小時之后,測量小鼠的基礎(chǔ)血糖值并進(jìn)行記錄。然后對這些小鼠依次進(jìn)行稱重,并根據(jù)小鼠的體重計(jì)算出各自需要注射的葡萄糖溶液的體積(2g/kg),在給小鼠腹腔注射完對應(yīng)量的葡萄糖溶液的15分鐘,30分鐘,60分鐘,120分鐘后,分別測量小鼠的血糖值并進(jìn)行記錄,將兩種敲除小鼠的血糖變化情況分別與對照組進(jìn)行比較。3.檢測敲除小鼠的胰島形態(tài)用Ins2-Cre+/-Cul4bfl/Y小鼠或Sst-Cre+/-Cul4b/Y 小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),處死小鼠后迅速取出敲除小鼠和對照小鼠的胰腺,稱重,4%多聚甲醛固定后,分別用濃度為10%,20%和30%的蔗糖溶液對胰腺進(jìn)行梯度脫水處理,之后對胰腺組織進(jìn)行包埋并切片染色,所使用的一抗為Insulin和Somatostatin,并用染料DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色。在熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,檢測這兩種敲除小鼠分別與對照組相比,其胰島密度,β細(xì)胞質(zhì)量和δ細(xì)胞數(shù)目這三項(xiàng)指標(biāo)是否有顯著差異。4.檢測敲除小鼠中的相關(guān)激素水平檢測小鼠血漿中的激素水平時,我們將Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y敲除小鼠與對照小鼠進(jìn)行禁食不禁水饑餓16小時,然后進(jìn)行尾部取血。并將小鼠進(jìn)行重新喂食2個小時,再次進(jìn)行尾部取血。將這些尾部取血得到的血液樣本在室溫靜置30分鐘,接著進(jìn)行4℃離心,用槍頭小心地吸取上清,然后分別用Insulin ELISA試劑盒和Somatostatin ELISA試劑盒,按照試劑盒提供的操作手冊進(jìn)行實(shí)驗(yàn),檢測血漿中的胰島素和生長抑素的水平。檢測胰島中的總激素含量時,我們將Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y敲除小鼠與對照小鼠的胰島分離出來之后,首先需要用低糖完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),待分離出來的胰島恢復(fù)狀態(tài)后,第二天用酸乙醇裂解培養(yǎng)過夜的敲除小鼠和對照小鼠胰島,離心取上清用Insulin ELISA試劑盒檢測胰島素的總含量�；蛴�100℃高溫煮15分鐘,離心取上清用Somatostatin ELISA試劑盒檢測生長抑素的總含量。檢測胰島的激素分泌水平時,我們將Sst-Cre+/-Cul-4bfl/Y敲除小鼠與對照小鼠的胰島分離出來之后,先用低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜待恢復(fù)狀態(tài),第二天用mKRBB緩沖液饑餓胰島1小時,然后分別用高糖(20 mM Glucose)或高鉀(105 mM KC1)刺激胰島一定的時間,取上清分別用Insulin ELISA試劑盒或Somatostatin ELISA試劑盒,按照試劑盒里提供的操作手冊進(jìn)行實(shí)驗(yàn),來檢測刺激后敲除小鼠和對照小鼠胰島中,胰島素和生長抑素的分泌水平。5.檢測原代胰島δ細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平通過熒光標(biāo)記分離得到Sst-Cre+-GFPfl/+ Cul4bfl/Y小鼠和對照小鼠的原代胰島δ細(xì)胞,首先加入Fura-2/AM溶液孵育細(xì)胞后,利用鈣成像儀器檢測在340 nm和380 nm波長交替激發(fā)后產(chǎn)生的光強(qiáng)度比值(F340/F380),通過光強(qiáng)度比值可以反映出胰島δ細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度變化。在我們給予原代胰島δ細(xì)胞高糖或高鉀刺激后,可以通過分析光強(qiáng)度比值檢測胰島δ細(xì)胞在接受刺激后細(xì)胞內(nèi)的鈣信號的發(fā)生頻率以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變。6.CUL4B穩(wěn)篩細(xì)胞系的構(gòu)建以及相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)構(gòu)建CUL4B敲低的TGP52穩(wěn)篩細(xì)胞系,通過ELISA的方法檢測高糖引起的生長抑素分泌和細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的變化,通過Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測鈣通道和腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)基因的mRNA以及蛋白水平。構(gòu)建CUL4B過表達(dá)的TGP52穩(wěn)篩細(xì)胞系,通過免疫共沉淀技術(shù)研究CUL4B對Cav1.2和AC6的調(diào)控。7.染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)實(shí)驗(yàn)通過CHIP實(shí)驗(yàn)研究CRL4B-PRC2復(fù)合物對Cav1.2和AC6的調(diào)控機(jī)制。分別檢測CRL4B的重要成分CUL4B和DDB1,以及PRC2的重要成分EZH2,是否會和Cav1.2和AC6的啟動子區(qū)域有結(jié)合,同時檢測δ細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子HHEX在這一過程之中是否參與發(fā)揮作用。研究結(jié)果1.我們研究發(fā)現(xiàn),在小鼠的胰島β細(xì)胞中特異性敲除Cul4b后,對其糖代謝水平以及葡萄糖耐量沒有影響。而胰島δ細(xì)胞特異性敲除Cul4b的小鼠,其餐后血糖水平與對照小鼠相比明顯升高,且葡萄糖耐量受損。2.我們發(fā)現(xiàn),對于胰島δ細(xì)胞特異性敲除Cul4b的小鼠,高糖和高鉀引起的胰島素分泌水平與對照小鼠相比明顯降低,而生長抑素的分泌水平明顯升高。3.通過對敲除小鼠分離出來的原代胰島δ細(xì)胞進(jìn)行鈣離子檢測,發(fā)現(xiàn)胰島δ細(xì)胞中特異性敲除CUL4B后,高糖和高鉀所引起的δ細(xì)胞鈣頻率和鈣信號變化,與野生小鼠的胰島δ細(xì)胞相比都有顯著升高。4.構(gòu)建了 CUL4B敲低的TGP52穩(wěn)篩細(xì)胞系,檢測了相關(guān)基因的mRNA水平以及蛋白表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)敲低CUL4B之后,L型鈣通道Cav1.2和腺苷酸環(huán)化酶AC6表達(dá)與對照組相比明顯升高。并且在CUL4B敲低的TGP52細(xì)胞系中,我們發(fā)現(xiàn)由葡萄糖所引起的細(xì)胞內(nèi)cAMP水平與對照組細(xì)胞相比有著明顯升高5.構(gòu)建了 CUL4B過表達(dá)的TGP52穩(wěn)篩細(xì)胞系,通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CRL4B-PRC2復(fù)合物可以和HHEX發(fā)生相互作用,共同調(diào)控Cav1.2和AC6的表達(dá),同時也證明了該復(fù)合物對Cav1.2和AC6的調(diào)控機(jī)制具有細(xì)胞特異性。6.通過對胰島δ細(xì)胞系TGP52進(jìn)行生理刺激,發(fā)現(xiàn)CRL4B-PRC2復(fù)合物可以通過調(diào)控Cav1.2和AC6的表達(dá)水平,進(jìn)而影響胰島δ細(xì)胞中生長抑素的分泌,以及對β細(xì)胞的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R587.1
【部分圖文】：

我們選取了邋１２周鼠齡的必／此小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分離出小鼠胰島后，通過逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＣＵＬ４Ｂ以及它的同源蛋白ＣＵＬ４Ａ的表達(dá)水平，用ＧＡＰＤＨ作逡逑為內(nèi)參（圖１Ａ）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ｗ辦小鼠胰島中ＣＵＬ４Ｂ的表達(dá)與對照小鼠相逡逑比顯著降低，而ＣＵＬ４Ａ的表達(dá)與對照小鼠相比無明顯變化。逡逑Ａ邐Ｂ邋°ｄｂ／＋逡逑ｏ邋ｄｂ／ｄ邋ｂ邐門一６逡逑ｄｂ／＋邋ｄｂ／ｄｂ邐１－５］邋ｎ．ｓ．邐＊＊逡逑舊：ＣＵＬ４Ａ邋—邋一一邋—邐￥逡逑ＩＢ：ＣＵＬ４Ｂ邋邐邐吾邋１０邋去’■每逡逑－？—？逡逑舊：ＧＡＰＤＨ邋？S�？＿逦ｃ＾＇�(dān)咤危掊義希埃板澹桑�，逦，逦．逦，—辶x希茫眨蹋矗鈴危茫眨蹋矗洛義賢跡保�，Ｗｅｓｔｅｍｂe錚簦蠹觳猓保倉蓯罅淶謀兀匭∈笠鵲褐校茫眨蹋矗梁停茫眨蹋矗碌牡板義習(xí)妝澩鎪�。辶x賢跡保攏醞跡保戀耐臣品治黿峁�。辶x希疲椋紓酰潁邋澹保粒攏澹祝澹螅簦澹潁鑠澹猓歟錚簦簀澹幔睿溴澹瘢酰幔睿簦椋簦幔簦椋觶邋澹洌幔簦徨澹媯錚蟈澹茫眨蹋矗鈴澹幔睿溴澹茫眨蹋矗洛澹穡潁錚簦澹椋鑠義希歟澹觶澹歟簀澹椋鑠澹椋螅歟澹簦簀澹媯潁錚礤澹保玻鰨澹澹耄錚歟溴澹洌椋幔猓澹簦椋沐澹洌猓洌忮澹恚椋悖邋澹幔睿溴澹簦瑁澹椋蟈澹瑁澹簦澹潁錚紓錚酰簀義希歟椋簦簦澹睿睿幔簦澹螅義希玻瑰義

本文編號：2824814