目的:探討c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路在多聚左旋精氨(Poly-L-arginine,PLA)誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞凋亡中的作用及其分子機(jī)制。方法:1、細(xì)胞培養(yǎng):NCI-H292細(xì)胞生長(zhǎng)于10%胎牛血清+100 mg/L青霉素+100 mg/L鏈霉素+12mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液中,于37℃、5%CO_2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每2天換液1次。2、Western Blot法檢測(cè)JNK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)選擇PLA為凋亡誘導(dǎo)物,誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞NCI-H292的凋亡。分別以0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L濃度的PLA刺激NCI-H292細(xì)胞24小時(shí)后提取各組細(xì)胞總蛋白,采用Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)P-JNK/JNK表達(dá)有無(wú)差異。3、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)NCI-H292細(xì)胞凋亡情況將NCI-H292細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組、PLA組、SP600125組、PLA+SP600125組,按照分組要求提前1h用特異性JNK通路抑制劑SP600125預(yù)處理NCI-H292細(xì)胞,然后加入PLA,處理細(xì)胞24小時(shí)后收集各組細(xì)胞,采用Annexin V和PI雙染的方法,染色凋亡的NCI-H292細(xì)胞,并于4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞的檢測(cè)分析,觀察JNK通路抑制劑SP600125(10μM)作用前后細(xì)胞的凋亡情況。4、Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Casepase-3的表達(dá)采用Western Blot方法分別檢測(cè)空白對(duì)照組、PLA組、SP600125組、PLA+SP600125組中NCI-H292細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、Casepase-3的表達(dá)和信號(hào)通路蛋白JNK、P-JNK的表達(dá)。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA);兩兩間比較當(dāng)方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用Dunnett′s T3檢驗(yàn),P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、PLA濃度10 mg/L組作用NCI-H292細(xì)胞后JNK磷酸化水平與0mg/L組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.179),PLA作用濃度為20 mg/L組、40 mg/L組、60 mg/L組的JNK磷酸化水平與0mg/L組比較均增加,且呈現(xiàn)劑量依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.239,P均0.05)。2、空白對(duì)照組、PLA組、SP600125組、PLA+SP600125組NCI-H292細(xì)胞凋亡率分別為(5.13±1.12)%、(22.62±1.66)%、(5.69±0.18)%、(8.99±1.74)%,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=113.961,P0.001);PLA組NCI-H292細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組相比明顯增高(P0.001);PLA+SP600125組與PLA組比較細(xì)胞凋亡率明顯降低(P0.001)。3、PLA(40 mg/L)作用于NCI-H292細(xì)胞后,P-JNK/JNK比值與空白對(duì)照組相比明顯升高(F=31.778,P0.001);凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值降低(F=21.077,P0.01);Caspase-3表達(dá)明顯升高(F=31.768,P0.001)。4、特異性JNK通路抑制劑SP600125干預(yù)后,PLA+SP600125組相比PLA組NCI-H292細(xì)胞內(nèi)P-JNK/JNK比值顯著降低(P0.001);Bcl-2/Bax比值顯著升高(P0.001);Caspase-3表達(dá)顯著下降(P0.001)。結(jié)論:1、氣道上皮NCI-H292細(xì)胞內(nèi)JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路能夠被PLA激活;2、PLA可以誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達(dá)增加,抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低;3、JNK信號(hào)通路能通過(guò)促進(jìn)Bax、Caspase-3表達(dá),抑制Bcl-2表達(dá)介導(dǎo)PLA誘導(dǎo)的NCI-H292細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R562.25
【部分圖文】：

圖 1 PLA 作用 24 h 后 NCI-H292 細(xì)胞內(nèi) P-JNK/JNK 的表達(dá)“*”代表實(shí)驗(yàn)組與 0 mg/L 組比較：*P<0.05.Fig 1: The expression of P-JNK/JNK in NCI-H292 cells by Western blotCompared to controls：*P<0.05.P600125 抑制 PLA 對(duì) NCI-H292 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用據(jù)前面的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLA可誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞內(nèi)JNK信號(hào)通路的活化，用 10ul 濃度為 20 μmol/L 的 JNK 信號(hào)通路的特異性抑制劑 SP600125 預(yù)先NCI-H292 細(xì)胞 30min，采用 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè) SP600125 對(duì) PLANCI-H292 細(xì)胞凋亡率的影響。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、PLA 組、SP600125LA+SP600125 組 NCI-H292 細(xì)胞凋亡率分別為(5.13±1.12)%、(22.62±1.66)%、±0.18)%、(8.99±1.74) %；采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果，顯示各組間差異有

Caspase-3 及 P-JNK/JNK 的表達(dá)1.對(duì)照組；2.PLA 組；3.PLA+SP600125 組；4.SP600125 組；A：統(tǒng)計(jì)分與 Bax 條帶灰度值比值；B：統(tǒng)計(jì)分析 Caspase-3 與β-actin 條帶灰度值比統(tǒng)計(jì)分析 P-JNK 與 JNK 條帶灰度值比值；與對(duì)照組比較：**P<0.01，***P與 PLA 組比較：###P<0.001Fig 3: The expression of Bax, Bcl-2, Caspase-3 and P-JNK / JNK in NCI-H292 Cells inby SP6001251: control group, 2:PLA group, 3:PLA+SP600125 group, 4: SP600125 group; A. The baBcl-2/ Bax. B. The bar chart of Caspase-3/β-actin. C. The bar chart of P-JNK/JNK. Compcontrol group, **P<0.01，***P<0.001, Compared with PLA group, ###P<0.001.5 討論

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本文編號(hào)：2821203