【摘要】：背景及目的:糖尿病性膀胱病(Diabetic cystopathy,DCP)晚期主要表現(xiàn)為失代償性的膀胱興奮性下降和逼尿肌收縮無力,導(dǎo)致排尿困難、殘余尿增加、慢性尿潴留及充溢性尿失禁等臨床癥狀,現(xiàn)有理論認(rèn)為發(fā)生機(jī)制可能包括:支配膀胱的相關(guān)神經(jīng)損害,膀胱逼尿肌功能受損,膀胱泌尿上皮功能改變,膀胱間質(zhì)內(nèi)膠原纖維比例降低和彈力纖維合成增加和尿道協(xié)調(diào)失衡等。而現(xiàn)在越來越來的研究證實(shí),晚期逼尿肌細(xì)胞的功能異常和數(shù)量減少是導(dǎo)致膀胱收縮無力進(jìn)而出現(xiàn)一系列相應(yīng)癥狀的最直接原因。本課題擬深入研究和闡明逼尿肌細(xì)胞在DCP晚期逼尿肌無力發(fā)生中的病理基礎(chǔ)和分子機(jī)制,并初步觀察尿源性干細(xì)胞的修復(fù)治療效果。方法:第一部分:研究ICC細(xì)胞興奮異常在DCP逼尿肌無力中的作用我們通過腹腔注射鏈脲佐菌素加高脂高糖飲食建立大鼠糖尿病模型,將大鼠分為兩組:1.正常大鼠:NC;2.DCP大鼠:DCP。通過胰島素抵抗實(shí)驗(yàn)、膀胱測壓和纖維化分析鑒定模型建模成功;通過q RT-PCR、western blot和免疫熒光染色分析HCN通道核酸和蛋白表達(dá)分布差異;原代分離培養(yǎng)膀胱ICC細(xì)胞后,通過膜片鉗檢測HCN介導(dǎo)的Ih電流大小和通道活性差異;通過離體肌條張力測定和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測定比較HCN通道對膀胱收縮力和鈣離子活動的作用差異;透射電鏡分析ICC細(xì)胞數(shù)量和其上小窩結(jié)構(gòu)的表達(dá)差異,Western blot檢測小窩蛋白表達(dá)變化;免疫熒光染色和免疫共沉淀共定位小窩蛋白3和HCN通道蛋白,證明兩者間相互作用;使用si RNA轉(zhuǎn)染原代ICC細(xì)胞下調(diào)Caveolin-3表達(dá)水平,觀察比較Caveolin-3對HCN通道表達(dá)和通道功能活性的影響。第二部分:探討AGEs介導(dǎo)DCP逼尿肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制收集DCP患者膀胱樣本,檢測AGEs和RAGE的表達(dá)差異。再通過第一部分建模方法建立DCP大鼠模型,SD大鼠分為四組:正常大鼠:NC;DCP大鼠:DCP;DCP大鼠腹腔注射ALT-711治療:DCP+ALT-711;DCP大鼠口服AG治療:DCP+AG。通過檢測以下內(nèi)容指標(biāo),觀察DCP大鼠的疾病狀態(tài)特點(diǎn)和ALT-711、AG的治療效果:免疫組化和Elisa實(shí)驗(yàn)檢測血清、胰腺內(nèi)胰島素含量和膀胱內(nèi)AGEs的含量;繪制大鼠體重和空腹血糖變化曲線;膀胱測壓和離體肌條張力測定檢測膀胱排尿和收縮力變化;Western blot檢測RAGE、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控蛋白SOD-2、Caspase-3的表達(dá)差異,觀察和細(xì)胞凋亡密切的MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)差異;TUNEL染色和Masson染色檢測大鼠膀胱組織細(xì)胞凋亡和纖維化改變;原代分離培養(yǎng)膀胱逼尿肌細(xì)胞,通過外源性AGEs-BSA培養(yǎng)處理后,觀察其對細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS的濃度影響,探討時間和濃度依賴特性,檢測相關(guān)蛋白RAGE和SOD-2的表達(dá)變化;通過轉(zhuǎn)染si RNA-RAGE和si RNA-p38-MAPK后下調(diào)目的基因表達(dá)水平,檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度變化和細(xì)胞凋亡百分比,證實(shí)該信號通路在AGEs誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡中的作用。第三部分:初步觀察尿源性干細(xì)胞對DCP逼尿肌無力大鼠模型的治療作用原代分離培養(yǎng)人尿源性干細(xì)胞,初步觀察其增值和轉(zhuǎn)分化特性。將分離培養(yǎng)的人尿源性干細(xì)胞轉(zhuǎn)染攜帶e GFP的慢病毒進(jìn)行標(biāo)記,通過尾靜脈注射進(jìn)入DCP大鼠體內(nèi),觀察人尿源性干細(xì)胞在體內(nèi)重要器官的歸巢情況和治療效果,實(shí)驗(yàn)分組為:正常大鼠:NC;DCP大鼠:DCP;DCP大鼠注射人尿源性干細(xì)胞治療:DCP+USCs。觀察了大鼠血糖、體重、膀胱濕重、血生化指標(biāo)、大鼠糖代謝情況變化;膀胱測壓和離體肌條收縮實(shí)驗(yàn)觀察膀胱排尿功能和收縮力恢復(fù)情況;HE染色、Masson染色和TUNEL染色觀察大鼠逼尿肌纖維化和細(xì)胞凋亡情況;Western blot蛋白定量:α-SMA,Caspase-3。結(jié)果:1.低劑量鏈脲佐菌素腹腔注射聯(lián)合高脂高糖高蛋白飲食可較好的模擬2型糖尿病模型,注射12周后大鼠膀胱出現(xiàn)糖尿病性膀胱病逼尿肌無力的典型表現(xiàn);DCP大鼠膀胱中HCN通道四個亞型的核酸和蛋白表達(dá)量降低,HCN介導(dǎo)的Ih電流密度下降;HCN通道蛋白位于小窩結(jié)構(gòu)域內(nèi),小窩及其結(jié)構(gòu)蛋白Caveolin-3在DCP時表達(dá)降低,該蛋白可與HCN通道的四個亞型發(fā)生相互作用并正向調(diào)控HCN通道介導(dǎo)的Ih電流。2.DCP患者膀胱組織中AGEs含量和RAGE表達(dá)均顯著增加;口服氨基胍和腹腔注射阿拉氯胺治療DCP大鼠后,兩者均可在體阻斷AGEs的產(chǎn)生,進(jìn)而抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡,改善DCP大鼠的排尿功能和肌條收縮力;AGEs可在體外呈時間和濃度依賴性地誘導(dǎo)逼尿肌細(xì)胞活性氧ROS和細(xì)胞凋亡,使用si RNA干擾RAGE和p38-MAPK的表達(dá)后,AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS增加和細(xì)胞凋亡比率明顯受到抑制,相應(yīng)的標(biāo)志蛋白Caspase-3、SOD-2的表達(dá)也有所降低。3.成功在人尿液中分離提取了原代尿源性干細(xì)胞,并能有效增殖傳代,使用PDGF5ng/ml+TGFβ2.5ng/ml、VEGF 30ng/ml分別培養(yǎng)尿源性干細(xì)胞14天后,部分干細(xì)胞分化成上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。每隔一周進(jìn)行尾靜脈注射使用攜帶e GFP基因的尿源性干細(xì)胞后,干細(xì)胞可在胰腺歸巢,但未能在膀胱中檢測到歸巢細(xì)胞。但注射干細(xì)胞后,DCP膀胱纖維化和逼尿肌細(xì)胞凋亡得到有效機(jī)制,DCP大鼠逼尿肌收縮力和排尿功能也有不同程度改善。結(jié)論:1.膀胱ICC細(xì)胞的數(shù)量減少和其HCN通道蛋白表達(dá)和功能活性降低可能是DCP逼尿肌無力發(fā)生的重要分子基礎(chǔ),小窩結(jié)構(gòu)域內(nèi)的Caveolin-3可與HCN通道的四個亞型發(fā)生相互作用并調(diào)控HCN通道的活性。2.AGEs在膀胱內(nèi)過量堆積可激活RAGE/p38-MAPK信號通路誘導(dǎo)逼尿肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。3.原代分離人尿源性干細(xì)胞注射可抑制DCP膀胱纖維化和逼尿肌細(xì)胞凋亡,改善DCP大鼠逼尿肌收縮力和排尿功能。簡而言之,DCP的機(jī)制復(fù)雜,難以闡明�？赡苌婕半x子通道、神經(jīng)受體和多種細(xì)胞病理過程的變化。同源尿源性干細(xì)胞可能是一種新的治療資源。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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本文編號：2813206