【摘要】：糖尿病性膀胱病(diabetic cystopathy,DCP)是糖尿病患者常見的慢性并發(fā)癥之一,在2004年,Lee等統(tǒng)計DCP的患病率為25%?90%。在2011年,統(tǒng)計約有22.5%的糖尿病患者表現(xiàn)為膀胱過度活動癥,而在這些病例中又有48.0%的患者伴有尿失禁臨床癥狀。DCP的發(fā)病機制主要包括神經(jīng)病變、逼尿肌肌源性病變和氧化應(yīng)激損傷等,氧化應(yīng)激損傷是糖尿病膀胱功能損傷的重要因素,有效降低機體內(nèi)氧自由基的水平對保護糖尿病動物模型的神經(jīng)及血管結(jié)構(gòu)功能十分有利。至今為止,針對DCP的藥物仍需要繼續(xù)探索,利用天然抗氧化劑治療DCP已逐漸被推崇為研究的新熱點。肌苷是臨床上多年廣為應(yīng)用、無明顯不良反應(yīng)的藥物,而且大量研究表明肌苷能有效對抗氧化應(yīng)激損傷機體,提高細胞對缺氧、缺血的耐受力。Piezos離子通道是機械敏感性離子通道中的一種,其可感受細胞膜所受機械刺激的改變,立即作出反應(yīng),將細胞膜感受到的機械信號轉(zhuǎn)化為電信號或化學(xué)信號。在2010年,由Corey和Hudspeth等人研究發(fā)現(xiàn),在哺乳動物中,該通道家族包含Piezo1和Piezo2蛋白,分別由FAM38A和FAM38B基因編碼。Piezos離子通道存在于許多組織中,如膀胱、腎臟及神經(jīng)等,并且研究發(fā)現(xiàn),Piezos基因及其表達的蛋白與機體一些病理生理過程相關(guān),如Dehydrated hereditary stomatocytosis(DHS)、Distal arthrogyposis type 5(DA5)、Gordon syndrome(GS)、Marden-Walker syndrome(MWS)等。目前,Piezos通道蛋白在DCP中表達情況,少有文獻報道,本實驗以鏈尿佐菌素(Streptozocin STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型,觀察糖尿病對大鼠膀胱組織Piezos離子通道的影響情況,并用肌苷進行干預(yù)治療,分析肌苷對糖尿病大鼠膀胱組織中Piezos離子通道的保護作用,為DCP的藥物治療探索一個新的研究方向。第一部分肌苷治療DCP的形態(tài)學(xué)分析及相關(guān)氧化指標測定目的:目前針對DCP的治療仍缺乏有效藥物,研究天然抗氧化劑已經(jīng)逐漸成為當(dāng)今的新熱點。本研究目的在于觀察肌苷對糖尿病大鼠膀胱的保護作用以及探索肌苷的抗氧化應(yīng)激機制。方法:將60只成年大鼠隨機分為正常對照組,糖尿病組和糖尿病肌苷治療組,每組大鼠各20只,給予鏈脲佐菌素(60mg/kg)一次性腹腔注射以誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型,1周后取尾靜脈血,測血糖水平≥16.7mmol/L達到造模成功的標準。造模成功后肌苷治療組接受肌苷(75 mg/kg,ip,bid)治療,糖尿病組接受同量生理鹽水。肌苷治療干預(yù)4周、8周后,在兩個時間點分別從各組中取10只大鼠,取膀胱組織切片做蘇木精-伊紅(HE)染色、用免疫熒光法觀察膀胱組織中干細胞因子受體(c-kit)、神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor NGF)表達情況,電鏡下觀察各組大鼠膀胱組織的超顯微結(jié)構(gòu)。同時對大鼠膀胱組織進行TUNEL凋亡分析,并測定膀胱組織中谷胱甘肽(Glutathione GSH)、丙二醛(Malondialdehyde MDA)以及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase SOD)的含量和活性。結(jié)果:糖尿病組大鼠膀胱組織HE染色提示黏膜顯著增生,肌束排列紊亂,結(jié)構(gòu)松散,肌束斷裂,肌束間間隙明顯增寬,肌細胞萎縮,淋巴細胞浸潤,肌束間膠原纖維填充,血管增生充血,神經(jīng)束少見;在電鏡下觀察,可見肌細胞排列紊亂,中間連接消失,肌細胞和間質(zhì)細胞內(nèi)線粒體空泡化顯著,核膜皺縮,核仁消失,染色質(zhì)不規(guī)則邊集,凝聚成塊;免疫熒光結(jié)果提示NGF和c-kit信號均較正常對照組減弱;TUNEL檢測顯示凋亡細胞比例顯著增多,MDA在8周時顯著增加,SOD,GSH則顯著減少。肌苷治療組大鼠膀胱組織及細胞結(jié)構(gòu)較糖尿病組顯著改善,NGF和c-kit信號顯著增強,凋亡細胞比例顯著減少,且以上改善肌苷治療組在4周和8周時無顯著差別,8周時肌苷治療組膀胱組織中MDA含量較糖尿病組顯著減少。結(jié)論:氧化應(yīng)激在DCP的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用,肌苷能有效降低糖尿病大鼠膀胱組織中氧化應(yīng)激水平,減輕糖尿病大鼠膀胱組織的受損程度,保護膀胱的組織結(jié)構(gòu)和功能。第二部分肌苷對糖尿病大鼠膀胱組織piezos離子通道表達及分布的影響目的:觀察糖尿病大鼠膀胱組織內(nèi)piezos離子通道變化及肌苷(inosine)對糖尿病大鼠膀胱組織內(nèi)piezos離子通道的影響情況。方法:將54只大鼠隨機分為正常對照組(NC組),糖尿病對照組(DM組)和糖尿病肌苷治療組(Inosine組),每組18只大鼠,DM組和Inosine組大鼠分別給予鏈脲佐菌素(60mg/kg)一次性腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型,1周后測血糖在16.7mmol/L以上,視為造模成功。造模成功后,Inosine組大鼠腹腔注射肌苷(75 mg/kg,ip,bid)治療,DM組接受同量生理鹽水。在肌苷治療1、2、8周后,各組分別取3只大鼠,用免疫熒光法觀察大鼠膀胱組織中c-kit、Piezo1表達情況。再取3只大鼠,用QPCR定量分析Piezo1和Piezo2基因表達水平,并通過Western blot對大鼠膀胱組織內(nèi)Piezo1和Piezo2蛋白表達水平分析比較。結(jié)果:在肌苷治療1、2周后,Inosine組Piezo1和Piezo2基因及蛋白表達水平與NC組無顯著差別(P0.05),DM組Piezo1和Piezo2基因及蛋白表達水平較NC組和Inosine組顯著增高(P0.05),在肌苷治療第8周后,NC組、DM組和Inosine組大鼠膀胱組織中Piezo1和Piezo2基因及蛋白表達水平無顯著差別(P0.05)。結(jié)論:DCP初期,大鼠膀胱組織中Piezo1和Piezo2基因肌蛋白表達水平可顯著增加,增強膀胱對機械刺激的敏感性,是產(chǎn)生尿頻癥狀的重要因素之一,而肌苷可顯著抑制Piezo1和Piezo2增加,從而保護膀胱功能。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2
【圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文flow (e.g., kidneys, red blood cells), whereas Piezo2 is predominantly found in sensory tissues [e.g., dorsal root ganglia (DRG) sensory neurons and Merkel cells] that respond to touch(Figure 2). This distinct distribution pattern is apparently conserved in other species with multipleisoforms, as Piezo1 is found in erythrocytes and Piezo2 in Rohon Beard sensory neurons inzebrafish; Piezo2 expression has also been confirmed in sensory trigeminal ganglion neurons inthe star-nosed mole and birds (with a particular enrichment of Piezo2-expressing neurons intactile foraging waterfowl) [6,9 12]. The single Drosophila isoform is found both in sensorytissues (including Type I ciliated and Type II multidendritic sensory neurons) and in nonsensorytissues (including hindgut, aorta, and trachea), suggesting that Piezos may be less specialized inlower organisms [2]. In addition, a few cell types express both Piezo1 and Piezo2, raising thepossibility that they could form heteromeric channels with potentially distinct functions [13]. The12PressureKeratinocytesNeural morphologyNeural progenitor cellNeuronPiezo1 in Smooth Muscle Cells Is Hypertension-Dependent Arterial Graphical AbstractAutKeviArhaPate

-46-圖 6 在第 1、2、8 周時，利用免疫熒光雙標法標記 NC 組、DM 組和 inosine 組大鼠膀胱組織中 Piezo1(紅色)和 c-kit（綠色）的表達情況。第 1、2 周時，與 NC 組和 Inosine 組相比較，DM 組紅色信號較強；與 NC 組比較，Inosine 組熒光信號無顯著差別，第 8 周時各組紅色信號強度無顯著差異。綠色熒光信號在第 1周時各組無顯著差異，第 2、8 周時，與 NC 組和 Inosine 組相比較，DM 組較弱；與 NC 組相比，Inosine 組綠色熒光信號較弱，NC 組綠色熒光信號最強。標尺 20μm。U： 尿路上皮；D：逼尿肌， ↑ICCS

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文3.2 QRT-PCR 檢測結(jié)果分析與 NC 組和 Inosine 組相比，DM 組大鼠膀胱中 Piezo1 和 Piezo2 在第 1、2 周mRNA 表達水平明顯增強（P<0.05）甚至在第一周時 Piezo1 表達水平更加顯著（P<0.01），Inosine 組和 NC 組中 Piezo1 和 Piezo2 表達水平在第 1、2 周無明顯差異(P>0.05)，第 8 周時 NC 組、DM 組和 Inosine 組中 Piezo1 和 Piezo2 表達水平無顯著差異(P>0.05)。（圖 7）

【參考文獻】

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本文編號：2786845