【摘要】：一、研究背景強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病。疾病特征包括起止點炎、漸進發(fā)展的骶髂關節(jié)炎以及脊柱關節(jié)強直。該病好發(fā)于青壯年男性并且發(fā)病率較高,由于缺乏典型的早期癥狀和明確的早期生物標記物,AS通常在第一次臨床癥狀出現(xiàn)后的8-10年時間才能得到明確的診斷。晚期患者脊柱的骨性強直及髖關節(jié)的骨性融合將導致患者完全喪失生活和工作的能力,對家庭和社會產(chǎn)生極大負擔。脊柱及關節(jié)部分的骨化作為AS主要病理特征,目前關于它的發(fā)生、發(fā)展機制也尚不清楚。因此尋找AS的早期診斷標志物以及探索骨化發(fā)生的生物學機制一直是AS研究的熱點。自身抗體是多種自身免疫性疾病的免疫標記物,可作為早期診斷,疾病活動度的觀測,治療預后評估等的標志物。由于缺乏類風濕因子,強直性脊柱炎一直被認為是血清陰性脊柱關節(jié)病,血清抗體較少被考慮作為生物標記物進行研究。然而,近年來越來越多的證據(jù)表明B細胞和相應的體液免疫反應可能通過抗原提呈,抗體產(chǎn)生等方式參與AS的發(fā)病過程。因此,本課題試圖通過蛋白芯片在AS血液樣本中篩選到合適的可以作為AS早期診斷的標志物,并研究自身抗體相應的抗原蛋白在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用及機制,從而為強直性脊柱炎尋找合適的標志物及可能的治療靶點。二、研究目的第一部分:篩選強直性脊柱炎患者血漿內(nèi)的自身抗體并擴大樣本驗證Kaiso蛋白自身抗體在強直性脊柱炎血漿內(nèi)的表達情況。第二部分:探究Kaiso分子在體內(nèi)外實驗中對成骨分化進程的影響。第三部分:探索Kaiso分子調(diào)節(jié)成骨分化進程的具體機制。三、研究方法第一部分:(1)HuProt蛋白芯片篩選強直性脊柱炎患者及正常人血漿:經(jīng)過芯片封閉,芯片雜交,芯片檢測,數(shù)據(jù)提取與分析等步驟篩選出強直性脊柱炎患者血漿內(nèi)特異性的自身抗體。(2)血漿自身抗體表達水平的驗證:基于Meso Scale Discovery(MSD)技術(shù),利用夾心法,即將重組蛋白包被在板底,然后加入含有待測抗體的血漿樣本或陽性對照抗體進行孵育,再加入帶有sulfo標簽的抗待測抗體的二抗,最終利用電化學發(fā)光原理檢測,從而得出不同血漿樣本中的抗體表達水平。第二部分:(1)Kaiso分子過表達、敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的建立:通過病毒載體的構(gòu)建,慢病毒包裝,慢病毒感染細胞及嘌呤霉素篩選等實驗步驟完成慢病毒感染穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建。熒光定量PCR及蛋白免疫印跡實驗驗證過表達及敲減效率。(2)成骨分化的誘導及檢測:在培養(yǎng)基中添加50μg/ml抗壞血酸,10 mMβ-甘油磷酸鈉,50 ng/ml BMP2重組蛋白進行成骨誘導。在不同時間點使用PCR技術(shù)檢測骨化相關分子的變化、使用BCIP/NBT法進行染色檢測堿性磷酸酶的表達情況、使用堿性磷酸酶活性檢測試劑盒檢測堿性磷酸酶活性、使用茜素紅S染色法觀察鈣結(jié)節(jié)形成,從而評價不同細胞株成骨分化能力。(3)裸鼠體內(nèi)異位成骨實驗:將Kaiso過表達、敲減及相應對照的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞株接種到β-TCP材料支架上,細胞-材料復合物植入裸鼠肌肉內(nèi)部模擬活體環(huán)境,最后通過μCT掃描骨密度值及HE染色觀察材料上細胞的成骨情況來評價不同穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的成骨能力。第三部分:(1)RNA測序了解Kaiso過表達及敲減后基因表達的變化情況:通過提取RNA,RNA質(zhì)量檢測,建立cDNA文庫,上機檢測,測序結(jié)果分析等步驟檢測Kaiso過表達及敲減后差異表達的基因。并進一步進行GO、KEGG分析探究差異基因富集到的生物過程及信號通路。(2)使用PI3K-Akt信號通路抑制劑并加入成骨誘導液進行誘導,探究該信號通路是否參與Kaiso調(diào)控的成骨分化進程。(3)Kaiso分子結(jié)合的目的基因預測及驗證:根據(jù)生物信息學分析預測轉(zhuǎn)錄因子Kaiso可能結(jié)合的目的基因,ChIP-PCR、熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CKaiso與Itga10啟動子區(qū)域的結(jié)合及對Itga10的表達調(diào)控。(4)Itga10敲減實驗進一步驗證Itga10與PI3K-Akt信號通路及成骨分化的關系。四、研究結(jié)果第一部分:(1)通過HuProt蛋白芯片篩選強直性脊柱炎及正常人血漿,結(jié)果在強直性脊柱炎病人血漿中特異性篩選出MYLK,ASAP,SUGT1,BCL7A,EIF2C1,KAISO,IGHG17等蛋白自身抗體。(2)擴大相應樣本量利用MSD技術(shù)對其中感興趣的Kaiso蛋白抗體進行驗證,結(jié)果顯示早期AS患者體內(nèi)Kaiso抗體表達水平顯著高于正常人,晚期AS患者血漿內(nèi)表達水平與正常人無顯著差異。第二部分:(1)通過慢病毒感染技術(shù)成功構(gòu)建Kaiso基因過表達和敲減MC3T3-E1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。使用成骨誘導液分別對Kaiso過表達及敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株進行成骨誘導,結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨化相關分子、堿性磷酸酶的表達量及活性、鈣結(jié)節(jié)形成等反映成骨分化能力的指標在Kaiso過表達后被顯著抑制,而在Kaiso敲減后明顯增強。(2)裸鼠體內(nèi)異位成骨實驗證實Kaiso過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株體內(nèi)成骨能力低于對照,而Kaiso敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株體內(nèi)成骨能力與對照組相比顯著增強。第三部分:(1)對RNA測序所得的差異基因進行GO分析發(fā)現(xiàn),Kaiso過表達后下調(diào)的基因和Kaiso敲減后上調(diào)的基因均能夠富集到骨化相關生物過程。KEGG分析發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號通路在Kaiso過表達時被抑制,Kaiso敲減時被激活。其中Itga10的表達變化與PI3K-Akt信號通路變化一致。(2)PI3K-Akt信號通路抑制劑證實該通路參與Kaiso調(diào)控的成骨分化進程。(3)ChIP-PCR、熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)Kaiso可以通過結(jié)合存在于Itga10啟動子區(qū)域的特異序列從而抑制Itga10的表達。(4)Itga10敲減實驗證實Itga10的表達與PI3K-Akt信號通路成正相關,敲減Itga10能夠抑制細胞的成骨分化。裸鼠體內(nèi)異位成骨實驗進一步證實敲減Itga10對細胞成骨分化的抑制作用。結(jié)論本課題通過三個部分的研究揭示了Kaiso蛋白的自身抗體在早期強直性脊柱炎患者血漿內(nèi)高表達,進一步探究Kaiso分子與骨化這一強直性脊柱炎病理過程的關系,結(jié)果顯示Kaiso分子可通過結(jié)合Itga10來調(diào)控PI3K-Akt信號通路從而抑制成骨分化過程。這為強直性脊柱炎的早期診斷及骨化的干預治療提供了一個新的可能。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R593.23
【圖文】：

熒光信號中位數(shù)（F635 Median）扣除背景（B635）后用，則視為檢出，即血漿中存在相應抗體可結(jié)合靶抗原蛋白公式為(Signal-Background)/SD，用于評價檢出的特異性自身抗體臨床大樣本驗證原理步驗證蛋白芯片篩選的結(jié)果，采用 Meso Scale Discovery（身抗體檢測試劑盒。MSD技術(shù)是基于電化學發(fā)光技術(shù)的的酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assa的靈敏度和更寬的線性范圍，同時均一性好、信號穩(wěn)定。的含量時，實驗原理是利用夾心法，即將重組蛋白包被在抗體的血清樣本，或陽性對照抗體，進行孵育，再加入帶的二抗，最終利用電化學發(fā)光原理檢測[21, 22]。實驗原理圖

1-2：芯片上 Kaiso 蛋白與血漿中相應自身抗體結(jié)合陽性結(jié)果圖。a:AS 血漿篩選；b：對照組血漿篩選結(jié)果；c，d 分別為 AS 組和對照組兩組中箭頭所指位點放。（二）Kaiso（又稱 ZBTB33）自身抗體進一步臨床樣本驗證在挑選出的的自身抗體中，對相應的抗原蛋白進行進一步篩查，發(fā)現(xiàn) Kaiso可能與 AS 發(fā)病中的骨化進程關系密切。根據(jù)前述方法對 MSD 試劑盒檢測 Ka身抗體的條件進行摸索，結(jié)果顯示 Kaiso 重組蛋白包被濃度為 5ug/ml，40ul/孔清稀釋濃度為 250 倍；二抗?jié)舛葹?1ug/ml；在以上條件下獲得的信號值高且背。陽性對照抗體濃度點設置為 2,500, 625, 156.25, 39.06, 9.77, 2.44, 0.61, 0 ng/m據(jù)以上陽性對照抗體濃度梯度獲得標準曲線如圖 1-3。根據(jù)以上條件，應用SD 試劑盒對早期 AS 患者血漿 30 例、晚期 AS 患者血漿 20 例、RA 患者血漿、正常人血漿 20 例進行 Kaiso 自身抗體表達量的檢測，結(jié)果表示為 mean ±S平均值 ±標準誤）。如圖 1-4 所示，Kaiso 血漿自身抗體表達量在早期 AS 病人

圖 1-3：Kaiso 自身抗體檢測試劑盒標準曲線圖 1-4：Kaiso 自身抗體在不同組別人群血漿中的表達量。HC：healthy control, 正

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1 金s

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