【摘要】：目的:代謝綜合征是(MS)由多系統(tǒng)代謝紊亂引起的一組慢性疾病綜合征,包括肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病(T2DM)、心血管疾病和非酒精性脂肪肝病(NAFLD),已經(jīng)成為危害全世界人類健康的嚴(yán)重問題。MS的特征是胰島素抵抗和持續(xù)存在的慢性低豐度性代謝性炎癥。脂肪組織被認(rèn)為是代謝性炎癥的主要來源,而前脂肪細(xì)胞的數(shù)量占脂肪組織細(xì)胞的15-50%。近期研究還提示:在脂肪組織中募集巨噬細(xì)胞及促使促炎因子分泌的主要貢獻(xiàn)者并不是成熟的脂肪細(xì)胞,而是未分化的前脂肪細(xì)胞。CD36是一種調(diào)節(jié)多種免疫和代謝功能的清道夫受體,與MS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此,本研究擬觀察前脂肪細(xì)胞CD36在代謝性炎癥及MS中的作用,并初步探討其分子機(jī)制。方法:第一部分:人群健康調(diào)查數(shù)據(jù)來自于重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和金山分院門診體檢進(jìn)行健康體檢的28035名患者:首先根據(jù)患者血清hs-CRP值對(duì)患者進(jìn)行四分位數(shù)分組,分析不同程度炎癥狀態(tài)下血壓、血糖、血脂、肝功能的變化情況。然后,再根據(jù)體重系數(shù)、腰圍對(duì)患者進(jìn)行四分位數(shù)分組,分析不同肥胖程度下患者的炎癥水平。人脂肪組織樣品來自于重醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院接受腹部手術(shù)的患者:根據(jù)是否患有MS,分為正常對(duì)照(normal)組代謝綜合征(MS)組。HE染色分析人脂肪組織病理改變,免疫組化染色測(cè)定人脂肪組織CD36、F4/80的蛋白表達(dá),CD36和Pref-1的雙重染色分析CD36在人前脂肪細(xì)胞上的定位。第二部分:將6周齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為C57BL/6J普通飲食組(CTL,n=8)和C57BL/6J高脂飲食組(HFD,n=8)。將6周齡野生型小鼠(WT-HFD,n=8)和CD36基因敲除小鼠(CD36KO-HFD,n=8)進(jìn)行高脂飲食喂養(yǎng)。所有小鼠喂養(yǎng)14周,在喂養(yǎng)結(jié)束前一周做糖耐量試驗(yàn)和胰島素抵抗試驗(yàn)。喂養(yǎng)結(jié)束后,稱量體重和收集附睪脂肪組織樣本。CD36和Pref-1的雙重染色分析CD36在人前脂肪細(xì)胞上的定位,HE染色分析鼠脂肪組織病理改變;免疫組化染色測(cè)定鼠脂肪組織F4/80的蛋白表達(dá)。第三部分:FFA處理3T3-L1前脂肪細(xì)胞后,Western blot和單標(biāo)流式檢測(cè)CD36蛋白水平。轉(zhuǎn)染慢病毒載體以建立CD36超表達(dá)的3T3-L1前脂肪細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞系。油紅O和Bodipy染色分析細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚積情況;提取細(xì)胞蛋白,采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞CD36、ACC、PACC、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1蛋白表達(dá)水平;提取細(xì)胞RNA,采用QPCR檢測(cè)前脂肪細(xì)胞炎癥/趨化因子mRNA表達(dá)水平;運(yùn)用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前脂肪細(xì)胞CD36超表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞遷移的影響。第四部分:MitoSOX染色測(cè)定3T3-L1前脂肪細(xì)胞線粒體活性氧(mtROS)水平以評(píng)價(jià)線粒體氧化應(yīng)激,JC-1染色測(cè)定3T3-L1前脂肪細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)評(píng)價(jià)線粒體功能。Fluo-4/AM染色觀察胞內(nèi)Ca~(2+)含量,Fluo-4/AM與mitotracker共染分析線粒體內(nèi)鈣水平。使用2APB抑制IP3R介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體釋放鈣后,采用QPCR檢測(cè)前脂肪細(xì)胞炎癥/趨化因子mRNA的表達(dá),應(yīng)用Bodipy染色分析細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。結(jié)果:第一部分:健康調(diào)查數(shù)據(jù)顯示無菌性炎癥與多種代謝疾病呈正相關(guān),BMI和腰圍與無菌性炎癥呈正相關(guān)(P0.05)。對(duì)于脂肪組織染色結(jié)果顯示,與正常患者相比,來自MS患者的脂肪組織中CD36蛋白和F4/80蛋白表達(dá)增加,且CD36和Pref-1的共定位效率更高,表明MS患者的前脂肪細(xì)胞CD36表達(dá)增加(P0.05)。第二部分:與CTL組相比,HFD喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠具有肥胖、脂肪肝、糖耐量異常與胰島素抗性(P0.05)。F4/80染色顯示HFD喂養(yǎng)誘導(dǎo)脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多、誘發(fā)脂肪組織炎癥(P0.05)。CD36和Pref-1的共定位分析表明:在HFD誘導(dǎo)的MS小鼠模型上前脂肪細(xì)胞CD36的表達(dá)被上調(diào)(P0.05)。DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示CD36KO鼠模型構(gòu)建成功。與WT-HFD相比,CD36KO并沒有減輕小鼠的體重與脂肪重(P0.05);但是卻緩解了HFD誘導(dǎo)的糖耐量異常與胰島素抵抗(P0.05),同時(shí)CD36KO還保護(hù)小鼠免受HFD誘導(dǎo)的脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)(P0.05)。第三部分:Western blot結(jié)果顯示:FFA時(shí)間依賴性地增加3T3-L1前脂肪細(xì)胞中的CD36表達(dá)(P0.05)。CD36-PE單標(biāo)流式也表明FFA誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞CD36在膜上定位增加(P0.05)。用表達(dá)CD36的慢病毒載體轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細(xì)胞,CD36超表達(dá)增加FA的吸收,促進(jìn)脂質(zhì)合成,抑制lipophagy,促進(jìn)前脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚(P0.05)。CD36超表達(dá)還通過激活NF-κB p65和NLRP3炎性體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)(P0.05)。第四部分:JC-1與MitoSOX染色結(jié)果顯示:與NC相比,CD36超表達(dá)降低MMP、促進(jìn)mtROS的產(chǎn)生,提示CD36超表達(dá)介導(dǎo)線粒體功能障礙(P0.05)。細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)含量與分布實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CD36超表達(dá)增加細(xì)胞總Ca~(2+)和線粒體內(nèi)Ca~(2+)水平(P0.05)。用IP3R抑制劑2APB處理3T3-L1前脂肪細(xì)胞,抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體釋放鈣,可以保護(hù)細(xì)胞免受CD36超表達(dá)誘導(dǎo)的線粒體功能紊亂,并減輕炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)積聚,提示前脂肪細(xì)胞CD36通過IP3R介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體的鈣轉(zhuǎn)運(yùn),引起線粒體鈣超載并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)(P0.05)。結(jié)論:體內(nèi)實(shí)驗(yàn),在代謝綜合征(MS)患者或高脂誘導(dǎo)的MS小鼠模型中前脂肪細(xì)胞CD36表達(dá)增加伴脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多;CD36基因缺失可以減輕高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗和脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。體外實(shí)驗(yàn),游離脂肪酸可以誘導(dǎo)CD36在前脂肪細(xì)胞中的表達(dá);同時(shí)前脂肪細(xì)胞CD36超表達(dá)后,可以通過增加IP3R介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)引發(fā)線粒體鈣超載,后者誘導(dǎo)線粒體功能障礙和mtROS的產(chǎn)生,進(jìn)而促進(jìn)NLRP3炎性體活化,從而誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)和募集巨噬細(xì)胞,參與脂肪組織代謝性炎癥的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R589
【圖文】：

a) b) 對(duì)人群血糖的影響。a) Hs-CRP 對(duì)人群空腹血糖的影響;b) Hs-CR; *P <0.05 與第一四分位組比較，#P<0.05 第二四分位組比較，$P組比較。pacts of hs-CRP on blood glucose of the study human subjects. a) ting blood glucose of the study human subjects; b) Impacts of hs-Cbnormal blood glucose; *P < 0.05, versusthe first quartile; #P < 0.0third quartile; $P < 0.05, versus the third quartile.癥與血脂異常密切相關(guān)RP 的水平對(duì)研究人群進(jìn)行四分位數(shù)分組，每組研究人群的.3。與低四分位數(shù)組相比，高四分位數(shù)組的 TG、TC 比低四 高（P<0.05）；同時(shí)，血脂異常的患病率伴隨 hs-CRP 的水

; e) Hs-CRP 對(duì)人群載脂蛋白 A 的影響;f）Hs-CRP 對(duì)人群載脂蛋白 B 的影響; g）Hs-C人群血脂異�；疾÷实挠绊�; *P <0.05與第一四分位組比較, #P<0.05第二四分位組比較第三四分位組比較。igure 1.3 Impacts of hs-CRP on the blood lipids of the study human subjects. a) Impactshs-CRP on TC; b) Impacts of hs-CRP on TG; c) Impacts of hs-CRP on LDL; d) Impacts s-CRPon HDL; e) Impacts of hs-CRPon apoA; f) Impacts of hs-CRP on apoB; g) Impacths-CRP on the prevalence of dyslipidemia; *P < 0.05, versus the first quartile; #P < 0.05versus the third quartile; $P < 0.05, versus the third quartile..2.4 無菌性炎癥炎癥與肝功能異常密切相關(guān)根據(jù) hs-CRP 的水平對(duì)研究人群進(jìn)行四分位數(shù)分組，每組研究人群的肝功能情況參見圖 1.4。盡管沒有嚴(yán)重的肝功能損害，但是隨著 hs-CRP 的逐漸增高白蛋白含量逐漸降低（P<0.05），白蛋白主要由肝臟合成；而且，肝功能受損 ALT、AST 水平伴隨 Hs-CRP 的水平成遞增趨勢(shì)（P<0.05）。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文Pref1 是前脂肪細(xì)胞的標(biāo)記分子，在前脂肪細(xì)胞上表達(dá)，在脂肪細(xì)胞上不表達(dá)。Pref1 和 CD36 的免疫熒光共定位染色提示，與正常人群相比， MS 患者的脂肪組織中 Pref1 和 CD36 表達(dá)上調(diào)且共定位顯著增多，說明 MS 患者前脂肪細(xì)胞 CD36表達(dá)上調(diào)（（圖 1.8，P<0.05）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李秀鈞,錢榮立;胰島素抵抗及其臨床意義[J];中國(guó)糖尿病雜志;1999年03期

本文編號(hào)：2781425