本文關(guān)鍵詞：血管抑素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織改變的影響及其VEGF的表達(dá)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：1.研究目的及意義 糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最為常見的,也是重要的致盲性眼病.15年病程的糖尿病患者大約有10%因視網(wǎng)膜病變而發(fā)生嚴(yán)重視力障礙,約2%成為盲目。糖尿病性視網(wǎng)膜病變是糖尿病性微血管病變中最重要的表現(xiàn),是一種具有特異性改變的眼底病變,血-視網(wǎng)膜屏障(blood, retinalbarrier, BRB)破壞、新生血管形成,后期新生血管收縮牽拉引起視網(wǎng)膜脫離。DR的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,至今尚未完全闡明。但任何病理改變在本質(zhì)上均是體內(nèi)動態(tài)平衡的失調(diào),新生血管的形成亦然,血管刺激因素增強(qiáng)和(或)抑制因素減少使兩者平衡失調(diào)即所謂的“血管生成開關(guān)”形成。血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor, VEGF)是體內(nèi)促進(jìn)新生血管形成的主要因子之一.近年來在DR的發(fā)病機(jī)制以及治療的研究中廣受關(guān)注。 新近發(fā)現(xiàn)的血管抑素,經(jīng)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證明能特異的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,從而抑制新生血管形成,血管抑素的抗腫瘤血管生成研究已有大量報(bào)導(dǎo),眾多實(shí)驗(yàn)表明：血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在缺氧相關(guān)的視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生中起著最關(guān)鍵的作用。 因此,闡明糖尿病與視網(wǎng)膜VEGF之間的關(guān)系,探討血管抑素抑制新生血管作用機(jī)理,可為預(yù)防和治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變尋找有效手段,勢必為其臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),并產(chǎn)生巨大的社會和經(jīng)濟(jì)效益。 2.研究方法和過程 1)實(shí)驗(yàn)動物模型制作 選取健康SD大鼠80只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周并進(jìn)行自由飲水和進(jìn)食,實(shí)驗(yàn)前所有大鼠稱體重,且經(jīng)檢查眼前節(jié)均無病理改變,尾靜脈采血后經(jīng)血糖儀檢測血糖均在正常值范圍以內(nèi)。然后禁食12h,予以腹腔注射鏈脈佐菌素,劑量為60mg/kg,建立糖尿病模型,每天檢測血糖水平,血糖高于350mg/dl者認(rèn)為糖尿病大鼠模型誘導(dǎo)成功,造模成功共72只,隨機(jī)分為兩組：A組即造模實(shí)驗(yàn)組,B組即造模對照組,每組36只；再取正常SD大鼠36只,予以腹腔注射等體積的檸檬酸鹽緩沖溶液,作為C組即正常對照組。 (2)玻璃體腔注射 10g·L-1戊巴比妥鈉50mg·kg.1腹腔注射麻醉大鼠,美多麗散瞳,愛爾卡因表面麻醉,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后滴3g·L-1泰利必妥眼液預(yù)防感染。27號針頭打眼后以微量注射器(上海激光光學(xué)儀器廠)血管抑素溶液按7.5μg/5μl由大鼠左眼顳側(cè)角膜緣后1mm玻璃體內(nèi)注射,并確定無晶狀體損傷。A組大鼠均按此法予以左眼玻璃體腔內(nèi)注射血管抑素溶液；B、C組大鼠左眼球均注射等體積的PBS溶液。造模2周后各組大鼠每天注藥一次,連續(xù)注藥4天。 (3)視網(wǎng)膜組織病理切片制備及觀察 連續(xù)用藥后的第12天、33天、61天分別摘除各組12只大鼠的眼球迅速固定于4%多聚甲醛中,2小時(shí)后將眼前節(jié)部分去除,玻璃體腔中置入脫脂棉以防止發(fā)生視網(wǎng)膜脫離,繼續(xù)固定24小時(shí),酒精梯度脫水,透明后浸蠟包埋切片,厚度為4μm,將脫蠟至水的切片放入蘇木素水溶液中染色10min；氨水中分化數(shù)秒；流水沖洗1h后自來水沖洗后伊紅染液染色5min,自來水沖洗。脫水透明后封片。 (4)大鼠視網(wǎng)膜VEGF蛋白檢測：于第12天、33天、61天分別取各組12只大鼠的視網(wǎng)膜,用抗VEGF抗體進(jìn)行Western blot印跡分析,取每種組織的等量總蛋白(50μg),經(jīng)變性、電泳、電轉(zhuǎn)膜、加抗VEGF的多克隆抗體(1：1000)孵育,用間接酶聯(lián)檢測法進(jìn)行顯影。同一樣本經(jīng)洗脫處理后再加上抗p肌動蛋白(β-actin)抗體孵育、顯影。將顯影后所得到的信號使用光密度分析法進(jìn)行半定量分析,并使用β-actin標(biāo)準(zhǔn)化。 3.主要結(jié)果 (1)糖尿病大鼠模型的建立成功大鼠糖尿病模型的造模前后,觀察每周血糖及體重變化。造模后STZ造模組大鼠出現(xiàn)糖尿病的“三多一少’(多飲、多食、多尿及體重下降)癥狀,體重較正常對照組大鼠的體重明顯下降,其血糖值明顯高于同期正常對照組(P0.01)。STZ造模組的血糖值在1-4周呈逐漸升高趨勢,5-7周處于相對平穩(wěn)期。 (2)大鼠視網(wǎng)膜組織切片HE染色可見C組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞形態(tài)正常,無明顯病理變化。不同時(shí)期A、B組可見視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)疏松,組織明顯水腫,尤其是在靜脈血管周圍,細(xì)胞排列紊亂。不同時(shí)期A組染色可見視網(wǎng)膜水腫較B組輕,細(xì)胞排列相對整齊。 (3)血管抑素對模型大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)的影響B(tài)組大鼠視網(wǎng)膜的VEGF水平明顯高于A組STZ大鼠左眼的,A、B且都高于正常對照組即C組,隨時(shí)間的增加呈先下降后上升的趨勢；A組視網(wǎng)膜的VEGF水平隨時(shí)間的增加也呈先下降后上升的趨勢,且高于C組(第33天除外)。不同時(shí)間段C組視網(wǎng)膜的VEGF水平?jīng)]有發(fā)生變化。 4.主要結(jié)論 以前人們普遍認(rèn)為,糖尿病性視網(wǎng)膜病最早發(fā)生的病變是在糖尿病病程中、后期出現(xiàn)的視網(wǎng)膜微血管的病變。然而,近年來研究表明,在糖尿病早期階段,視網(wǎng)膜就已經(jīng)發(fā)生了病理改變。 本實(shí)驗(yàn)選用雄性SD大鼠按60mg/kg體質(zhì)量腹腔注射STZ,誘發(fā)接近人類1型DM的大鼠模型,形成糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期病變,造模成功率達(dá)90%,可見STZ大鼠模型安全、可靠、方便、可行,成功率高。 本實(shí)驗(yàn)通過對視網(wǎng)膜HE染色發(fā)現(xiàn),STZ糖尿病大鼠12天時(shí)大鼠視網(wǎng)膜HE染色各層未能觀察到明顯的變化。糖尿病33天時(shí),視網(wǎng)膜內(nèi)發(fā)生可見的病理變化,組織發(fā)生一定程度的水腫。隨病程延長至61天時(shí),視網(wǎng)膜各層病理改變逐漸加重,也說明在糖尿病病程最初期,視網(wǎng)膜各層的組織學(xué)病變并不明顯,且視網(wǎng)膜各層的組織病變是隨病程進(jìn)展而逐漸發(fā)生的。此外,注射了PBS的B組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)外核層分離,內(nèi)核層細(xì)胞排列紊亂,密度降低,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少,而注射了的血管抑素的A組明顯減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生,組織水腫情況好轉(zhuǎn)。 綜上所述,本次研究通過對視網(wǎng)膜VEGF的差異表達(dá)檢測,得出注射血管抑素能明顯降低STZ糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的VEGF表達(dá)水平,但是仍稍高于對照組,證實(shí)了糖尿病性視網(wǎng)膜中VEGF的高表達(dá),且說明血管抑素在DR的治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：血管抑素 糖尿病性視網(wǎng)膜病變 新生血管 VEGF
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R587.2;R774.1
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-31
• 第一部分 材料與方法31-37
• 1. 糖尿病大鼠模型的建立31-32
• 2. 玻璃體腔內(nèi)注射32-33
• 3. 視網(wǎng)膜組織切片的制備33-35
• 4. 免疫組化檢測35-37
• 第二部分 結(jié)果37-43
• 1. 模型建立結(jié)果37
• 2. 玻璃體腔內(nèi)注射血管抑素觀察結(jié)果37-38
• 3. 模型大鼠視網(wǎng)膜組織切片38-40
• 4. 血管抑素對模型大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)的影響40-43
• 第三部分 討論43-48
• 1. 實(shí)驗(yàn)性STZ糖尿病動物模型評價(jià)43-44
• 2. 視網(wǎng)膜組織病理變化的討論44-45
• 3. VEFG在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)及血管抑素對其影響討論45-48
• 第四部分 缺點(diǎn)與不足48-49
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果49-50
• 參考文獻(xiàn)50-60
• 致謝60-61

【參考文獻(xiàn)】

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1 宋鄂,董宇,韓麗娜,隋東明,徐琪,王心蕊,吳稼祥;Diabetic retinopathy:VEGF, bFGF and retinal vascular pathology[J];Chinese Medical Journal;2004年02期

  本文關(guān)鍵詞：血管抑素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織改變的影響及其VEGF的表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：277425