【摘要】：目的隨著經(jīng)濟發(fā)展、飲食習(xí)慣和生活方式的改變,肥胖發(fā)病率逐年攀升,肥胖問題日趨嚴重。肥胖可影響血液中糖類和脂類的水平,進而引發(fā)高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、脂肪性肝病等多種代謝性疾病。肥胖已成為世界范圍內(nèi)最為嚴重的健康問題之一,造成巨大的醫(yī)療和經(jīng)濟負擔。肥胖發(fā)生的主要原因是過量的能量攝入和運動缺乏,但它們無法完全解釋當前肥胖發(fā)病率上升如此之快的原因。一系列研究表明,內(nèi)分泌干擾物(Endocrine DisruPting Chemicals,EDCs)的暴露與肥胖密切相關(guān)。加利福尼亞大學(xué)的Blumberg教授將這類物質(zhì)命名為肥胖激素(Obesogens),有機錫是其中最具代表性的一類。我們和其他研究小組的研究都已證明青春前期暴露于低劑量的三丁基錫(Tributyltin,TBT)可以導(dǎo)致小鼠成年期肥胖。肥胖是II型糖尿病的病因之一。TBT誘導(dǎo)的肥胖是否影響胰島素的敏感性從而誘發(fā)胰島素抵抗,罕有文章報道。胰島素作用的經(jīng)典通路是PI3K-Akt信號通路。在機體攝食后,胰島分泌的胰島素通過血液作用于細胞膜表面的胰島素受體。激活的胰島素受體進而活化胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(PhosPhoinositide 3-kinase,PI3K),進而催化激活蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt);激活后的Akt可通過調(diào)節(jié)一系列下游分子,包括糖原合成酶激酶-3等(Glycogen synthase kinase 3,GSK3)來增加糖原的生成,同時使磷酸化叉頭框蛋白O1(ForkheadboxProteinO1,Fox01)出核失活,從而達到抑制糖異生基因的表達,降低了機體血糖。PI3K-Akt信號通路在細胞的代謝過程中起極其重要的作用并受多種因素調(diào)節(jié)。因此,研究TBT對PI3K-Akt信號通路的影響可以更好的揭示TBT對哺乳動物產(chǎn)生肥胖及相關(guān)疾病的機制。本課題將基于以下幾方面來探析TBT誘導(dǎo)肥胖的效應(yīng)機制和分子基礎(chǔ);1)暴露于環(huán)境水平的TBT后引起相應(yīng)的表型改變:體重、體脂率、血脂指標等;2)TBT暴露誘發(fā)的肥胖是否伴隨著糖代謝紊亂;3)采用油紅O染色和免疫組化檢測TBT暴露對肝臟及肝臟中AKT活性的影響;4)免疫印跡實驗進一步驗證TBT對肝臟、肌肉組織中PI3K-Akt通路的影響;5)采用定量PCR擴增技術(shù)檢測TBT對脂肪分化相關(guān)因子和Akt2基因表達的影響;6)通過流式細胞技術(shù)分析TBT暴露對脂肪干細胞分化的影響;方法1.TBT染毒實驗21日齡雄性SPF級ICR小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后根據(jù)體重隨機分成為3組,每組10只。小鼠每3天進行一次腹腔注射,周期30天。注射物為溶劑對照(玉米油)、溶于玉米油的TBTCl,其染毒劑量為5、50 μg/kg(按照5ml/kg·bw注射)。每次腹腔注射前稱量并記錄體重,根據(jù)當天的體重調(diào)整注射量。最后一次TBTC1染毒后,對小鼠再進行30天的正常飼養(yǎng)。2.口服葡萄糖耐量試驗檢測為了檢驗TBT暴露是否影響小鼠的葡萄糖代謝,我們測定了小鼠的空腹血糖并進行了口服葡萄糖耐量試驗。實驗結(jié)束前3天,各組小鼠禁食過夜后,測定了小鼠的血糖濃度,即為小鼠的空腹血糖濃度。之后,每只小鼠經(jīng)口灌胃葡萄糖溶液(2g/kg·bw),并于灌胃后15分鐘,30分鐘,60分鐘和120分鐘尾靜脈血液采樣測量小鼠的血糖水平。3.TBT暴露組小鼠肥胖表型的檢測實驗終點時,每個劑量組隨機抽取7只小鼠,稱量體重,輕微麻醉后從小鼠眼眶后靜脈叢采血,室溫下靜置2h后,3000g*15分鐘分離血清并儲存于-80°C以檢測血清中甘油三酯(TG,Triglyceride)、總膽固醇(TC,total cholesterol)、瘦素、脂聯(lián)素及高密度脂蛋白(HDL,high density lipoprotein)和低密度脂蛋白(LDL,low density lipoprotein);小鼠取血后頸椎脫臼法處理,解剖、分離附睪脂肪組織和腎周脂肪組織,稱重后液氮速凍,保存于-80℃冰箱;分離小鼠肝臟并儲存于4%多聚甲醛溶液中。將每組剩余的小鼠腹腔注射1U/kg體重的胰島素,8分鐘后處死小鼠,迅速分離肝臟、大腿骨骼肌肌肉組織,將一部分肝臟置于4%多聚甲醛溶液中,剩余的肝臟和肌肉組織在液氮中速凍后-80℃保存。4.油紅0染色肝臟組織固定24h后,采用不同濃度的蔗糖溶液梯度脫水,OCT包埋后冷凍切片,做油紅O染色,觀察TBT暴露是否會引起小鼠肝臟脂肪堆積。5.免疫組化法檢測免疫組化方法檢測注射胰島素后小鼠肝臟中Akt及其磷酸化蛋白的表達,探討TBT暴露對肝臟中Akt的活性影響。6.Western blotting 檢測Western blotting檢測肝臟、骨骼肌中Akt及其磷酸化型蛋白表達情況,探討TBT暴露對PI3K-Akt通路的影響。7.流式細胞技術(shù)檢測TBT對附睪脂肪組織中干細胞的影響21日齡的雄性SPF級ICR小鼠10只,適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后分為兩組(玉米油和50/μg/kgTBTCl組),小鼠每3天進行一次腹腔注射,周期30天。最后一次TBTCl染毒處理后,小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)20天后,連續(xù)3天注射Brdu 50 mg/kg。再過1周后處死小鼠,取其附睪脂肪組織,膠原酶消化后,用DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含10%小牛血清)沖洗,離心(269 g,10 min)重懸,200目篩網(wǎng)除去組織塊,離心沉淀收取脂肪干細胞;對分離的脂肪干細胞加入抗-Brdu、CD29、Sca-1等抗體檢測TBT對脂肪組織中干細胞分化的影響。8.定量RT-PCR分析使用Trizol提取脂肪組織總RNA,并使用定量RT-PCR分析脂肪生成主要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、C/EBPs和各種標志基因的表達情況。以GAPDH為內(nèi)參,檢查各靶基因融解曲線并分析各目的基因的相對表達情況。研究TBT暴露對脂肪組織中脂肪生成主要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子表達的影響。結(jié)果1.TBT暴露增加了小鼠體重和附睪脂肪組織的質(zhì)量實驗期間,對照組和各TBT暴露組小鼠活動及精神狀況正常,各組之間小鼠毛色油光發(fā)亮,無戧毛情況。體重測試結(jié)果顯示,相對于對照組,50μg/kg TBTC1組小鼠從暴露15天后直至實驗終點小鼠體重顯著增加(P0.05)。解剖結(jié)果顯示50μg/kg TBTCl組小鼠附睪脂肪組織質(zhì)量也顯著增加(P0.01)。2.TBT暴露降低了小鼠的葡萄糖耐受性空腹血糖測試結(jié)果顯示,與對照組相比,暴露于TBT組小鼠的空腹血糖指標沒有顯著性變化�？诜咸烟悄土吭囼灲Y(jié)果顯示,在60、120分鐘時,50μg/kg TBTCl組小鼠血糖濃度顯著高于對照組(P0.05;P0.01)。這表明TBT暴露會降低小鼠的葡萄糖利用率并導(dǎo)致血糖耐量異常。3.TBT對小鼠血脂水平的影響血脂水平分析結(jié)果顯示TBT處理導(dǎo)致小鼠血脂水平呈劑量依賴性增長,相對于對照組,50μg/kgTBTCl組小鼠的TC升高了 23%(P0.01)、TG升高了 28%(P0.05)、HDL升高了24%(P0.01),LDL升高了107%(P0.001)。TBT處理導(dǎo)致TBT暴露組小鼠內(nèi)臟器官周圍的脂肪質(zhì)量顯著增加并伴隨高脂血癥,所以我們進一步檢測了脂肪組織分泌的脂聯(lián)素和瘦素,結(jié)果顯示5和50μg/kgTBTCl組中的脂聯(lián)素的濃度均顯著低于對照組(P0.01;P0.001),但TBT暴露組小鼠血清瘦素水平與對照組相比無顯著性差異。4.TBT暴露誘發(fā)非酒精性脂肪肝小鼠肝臟油紅O染色結(jié)果顯示,與對照組相比,TBT暴露組的肝臟內(nèi)脂滴含量增加并呈劑量依賴性。低劑量組中,小鼠肝臟內(nèi)有少量區(qū)域檢測到脂滴聚集,而高劑量組小鼠肝臟內(nèi)有較多的脂滴充盈于肝細胞內(nèi),實驗結(jié)果表明TBT暴露可導(dǎo)致小鼠肝臟脂肪代謝紊亂并誘發(fā)非酒精性脂肪肝。5.TBT暴露降低了小鼠Akt的活性葡萄糖耐量實驗和肝臟油紅O染色顯示TBT處理可影響小鼠對胰島素的敏感性。為了檢測TBT暴露組小鼠對胰島素的反應(yīng)能力的影響,我們用免疫組化法檢測注射胰島素后小鼠肝臟中的Akt、P-Akt蛋白表達情況。與對照組相比,暴露于TBT組小鼠的P-Akt/Akt比值顯著降低(P0.001)。為進一步驗證TBT暴露對PI3K-Akt通路的影響。我們檢測注射胰島素后小鼠肝臟和骨骼肌組織中的Akt、P-Akt(Ser473)以及P-Akt(T308)蛋白表達情況,檢測結(jié)果顯示TBT暴露未對總Akt表達未發(fā)生顯著性的改變,但P-Akt(Ser473)以及P-Akt(T308)的表達顯著降低。提示TBT暴露會降低小鼠Akt的活性。6.TBT暴露對BrdU標記的脂肪干細胞的影響為進一步探索TBT暴露對脂肪干細胞的影響,我們采用BrdU標記法檢測對照組與50μg/kgTBTCl組小鼠脂肪干細胞的分化情況。相對于對照組,TBT暴露組的CD29+CD34—群、CD29+Sca-1+群、CD29+BrdU-群顯著降低,而其他群組無明顯差異。7.TBT暴露影響脂肪組織中脂肪生成主要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達定量PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,50μg/kgTBTCl組Pref-1、Akt2相關(guān)基因表達量顯著降低(P0.01;P0.05)。這表明TBT暴露會影響脂肪組織中脂肪生成主要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達。結(jié)論1.青春期暴露于環(huán)境水平的TBT會誘發(fā)肥胖及代謝綜合征。2.環(huán)境水平TBT的暴露可能會影響脂肪干細胞的分化
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R589.2
【圖文】：

１．邋ＴＢＴ暴露增加小鼠體重和附睪周圍脂肪組織的質(zhì)量逡逑在整個實驗期間，對照組和各個ＴＢＴ暴露組小鼠活動及精神狀況正常，各逡逑組之間小鼠毛色油光發(fā)亮，無戧毛情況。如圖２所示，實驗開始時由于是按體重逡逑隨機分組，各組雄性小鼠體重均數(shù)幾乎相等，顯示小鼠按體重分配均衡；小鼠體逡逑＾邐重標準差也比較小，提示本次所采用小鼠體重的離散程度較小。隨著暴露次數(shù)的逡逑增加，各組小鼠體重開始出現(xiàn)差異，暴露于ＴＢＴＣ１１５天后，５０／Ｙｇ／ｋｇＴＢＴＣｌ組逡逑小鼠體重明顯高于對照組（戶＜邋仍，圖２）。為了驗證ＴＢＴ組小鼠體重增加是否逡逑伴隨著脂肪組織的增加，我們測量了小鼠附睪脂肪組織和腎臟周圍脂肪組織的質(zhì)逡逑量，結(jié)果如圖３所示，與對照組相比，５０噸／ｋｇＴＢＴＣ丨組小鼠附睪脂肪組織質(zhì)量逡逑也顯著增加（ＰＣ邋圖３），與附睪脂肪組織不同，各暴露組小鼠腎周脂肪組逡逑織質(zhì)量雖然呈現(xiàn)出上升的趨勢

小鼠體重明顯高于對照組（戶＜邋仍，圖２）。為了驗證ＴＢＴ組小鼠體重增加是否逡逑伴隨著脂肪組織的增加，我們測量了小鼠附睪脂肪組織和腎臟周圍脂肪組織的質(zhì)逡逑量，結(jié)果如圖３所示，與對照組相比，５０噸／ｋｇＴＢＴＣ丨組小鼠附睪脂肪組織質(zhì)量逡逑也顯著增加（ＰＣ邋圖３），與附睪脂肪組織不同，各暴露組小鼠腎周脂肪組逡逑織質(zhì)量雖然呈現(xiàn)出上升的趨勢，但未表現(xiàn)出顯著性變化（Ｐ＞邋０．０５，圖３）。附睪逡逑脂肪組織質(zhì)量與小鼠體重呈正相關(guān)關(guān)系（ｒ邋＝０．５６５，尸＝０．㈨７，圖４），而腎周脂逡逑肪組織質(zhì)量與小鼠體重無相關(guān)關(guān)系（Ｐ＝０．０５２，圖５）。因為附睪脂肪組織質(zhì)量與逡逑１邐小鼠體重呈正相關(guān)關(guān)系，我們對小鼠體重和小鼠附睪脂肪組織質(zhì)量進行協(xié)方差分逡逑析。如圖６所示，相對于對照組．，５０／／ｇ／ｋｇＴＢＴＣｌ組小鼠附睪脂肪組織質(zhì)量顯著逡逑增加（Ｆ＝５．０５１，尸＝６＞．似火圖６）。逡逑５0．0邋廠邐ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑＊邋＊＊邋丁邐５ｐｇ／ｋｇ逡逑｜邋４0邋０邐－邐＾十—逡逑ｆ邋３０．０邋－逡逑？邋＂邋／逡逑２０．０邋邐１邐１邐１邐１逡逑２０邐４０邐６０邐８０邐１００逡逑Ａｇｅ（ｄａｙｓ）逡逑圖２．邋ＴＢＴ暴露對小鼠體重的影響逡逑注：暴露于不同劑量ＴＢＴＣ１組的小鼠隨著暴露時間的體重變化；與對照組相比

也顯著增加（ＰＣ邋圖３），與附睪脂肪組織不同，各暴露組小鼠腎周脂肪組逡逑織質(zhì)量雖然呈現(xiàn)出上升的趨勢，但未表現(xiàn)出顯著性變化（Ｐ＞邋０．０５，圖３）。附睪逡逑脂肪組織質(zhì)量與小鼠體重呈正相關(guān)關(guān)系（ｒ邋＝０．５６５，尸＝０．㈨７，圖４），而腎周脂逡逑肪組織質(zhì)量與小鼠體重無相關(guān)關(guān)系（Ｐ＝０．０５２，圖５）。因為附睪脂肪組織質(zhì)量與逡逑１邐小鼠體重呈正相關(guān)關(guān)系，我們對小鼠體重和小鼠附睪脂肪組織質(zhì)量進行協(xié)方差分逡逑析。如圖６所示，相對于對照組．，５０／／ｇ／ｋｇＴＢＴＣｌ組小鼠附睪脂肪組織質(zhì)量顯著逡逑增加（Ｆ＝５．０５１，尸＝６＞．似火圖６）。逡逑５0．0邋廠邐ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑＊邋＊＊邋丁邐５ｐｇ／ｋｇ逡逑｜邋４0邋０邐－邐＾十—逡逑ｆ邋３０．０邋－逡逑？邋＂邋／逡逑２０．０邋邐１邐１邐１邐１逡逑２０邐４０邐６０邐８０邐１００逡逑Ａｇｅ（ｄａｙｓ）逡逑圖２．邋ＴＢＴ暴露對小鼠體重的影響逡逑注：暴露于不同劑量ＴＢＴＣ１組的小鼠隨著暴露時間的體重變化；與對照組相比，＊戶＜邋０．０５，逡逑＊＊Ｐ＜０．０ｌ0逡逑３工逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2767968