【摘要】：第一部分2型糖尿病對(duì)于大鼠骨折愈合影響的研究目的:通過(guò)給予SD大鼠高脂飼料喂養(yǎng),并腹腔注射低劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)來(lái)建立2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)動(dòng)物模型,并在此基礎(chǔ)上建立右側(cè)股骨干閉合性骨折動(dòng)物模型,以此模型為基礎(chǔ)對(duì)其骨折后第2、3周時(shí)骨折端愈合情況進(jìn)行分析,研究T2DM對(duì)于骨折愈合的影響。方法:1.32只健康雌性(Sprague-Dawley,SD)大鼠,2月齡,所有實(shí)驗(yàn)大鼠被隨機(jī)分為2組(n=16):骨折對(duì)照組(control fracture,CF),2型糖尿病骨折組(T2DM+fracture,DF)。2.大鼠在骨折第2、3周行X線檢查后被處死并取材。檢測(cè)其血清內(nèi)各生化指標(biāo);利用番紅O-固綠染色,分析骨痂內(nèi)骨性、軟骨性和纖維性骨痂所占骨痂總面積的比值;對(duì)骨痂內(nèi)VEGF和α-SMA進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,依次分析骨痂內(nèi)VEGF的表達(dá)強(qiáng)度和血管密度。結(jié)果:1.T2DM模型建立后,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中DF組血糖值顯著高于CF組,T-CHO和TG濃度于骨折后第2、3周均顯著高于CF組(P0.05)。2.骨折后的第2、3周,DF組大鼠骨折愈合X線評(píng)分均顯著低于CF組(P0.05)。3.分析番紅O-固綠染色結(jié)果顯示,在骨折后第2周時(shí),DF組骨性和軟骨性骨痂的面積比均顯著低于CF組(P0.05),但其纖維性骨痂的面積比卻顯著高于CF組(P0.05)。在骨折后第3周時(shí),DF組骨性骨痂的面積比仍顯著低于CF組(P0.05),其纖維性骨痂的面積比仍顯著高于CF組(P0.05),但兩組間軟骨性骨痂的面積比無(wú)顯著差異。4.骨折后第2周時(shí),DF組骨痂中VEGF的表達(dá)量和血管密度均顯著低于CF組(P0.05),第3周時(shí),CF組和DF組骨痂中VEGF的表達(dá)量無(wú)明顯差異。DF組骨痂中的血管密度顯著高于CF組(P0.05)。第二部分雙側(cè)卵巢切除對(duì)2型糖尿病大鼠骨折愈合影響的研究目的:在建立T2DM動(dòng)物模型的同時(shí),切除大鼠雙側(cè)卵巢致其骨質(zhì)疏松,并在此基礎(chǔ)上建立右股骨干閉合性骨折模型,以研究此動(dòng)物模型對(duì)于骨折愈合的影響。方法:1.48只健康雌性SD大鼠,2月齡,實(shí)驗(yàn)大鼠被隨機(jī)分為3組(n=16):骨折對(duì)照組(control fracture,CF),2型糖尿病骨折組(T2DM+fracture,DF)、2型糖尿病并骨質(zhì)疏松骨折組(T2DM+Osteoporosis Fracture,DOF)。2大鼠在骨折第2、3周行X線檢查后被處死并取材。標(biāo)本行Micro-CT檢測(cè)后,骨組織徹底脫鈣,利用馬松(Masson)染色分析骨痂內(nèi)骨性和軟骨性骨痂所占骨痂總面積的比值;利用免疫組織化學(xué)染色方法,分析骨痂中ColⅡ和Caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果:1 T2DM模型成功建立后,DF組、DOF組大鼠血糖均明顯高于CF組。2通過(guò)X線片測(cè)量骨痂面積結(jié)果顯示,骨折后第2周時(shí),DF組和DOF組的骨痂面積均顯著小于CF組(P0.05),DOF組顯著小于DF組(P0.05);骨折后3周時(shí),CF組、DF組和DOF組之間無(wú)顯著差異。3 Micro-CT檢測(cè)顯示,在骨折后第2周時(shí),DOF組Tb.N顯著低于CF組和DF組(P0.05),CF組和DF組之間無(wú)顯著差異;DF組和DOF組Tb.Th均顯著低于CF組(P0.05),DF組和DOF組之間無(wú)顯著差異;DOF組Tb.Sp顯著高于CF組和DF組(P0.05),CF組和DF組之間無(wú)顯著差異。在骨折后第3周時(shí),DF組和DOF組Tb.N均顯著低于CF組(P0.05),DOF組顯著低于DF組(P0.05);DF組和DOF組Tb.Th顯著低于CF組(P0.05),DF組和DOF組之間無(wú)顯著差異;DF組和DOF組Tb.Sp顯著高于CF組(P0.05),DOF組顯著高于DF組(P0.05)。4分析Masson染色結(jié)果顯示,在骨折后第2周時(shí),DF組和DOF組骨性和軟骨性骨痂面積比均明顯小于CF組(P0.05),DOF組骨性骨痂面積比與DF組無(wú)顯著差異,DOF組軟骨性骨痂面積比明顯小于DF組(P0.05);骨折后的第3周時(shí),DF組和DOF組骨性骨痂面積比均明顯小于CF組(P0.05),DOF組明顯小于DF組(P0.05),CF、DF和DOF三組間軟骨性骨痂面積比無(wú)顯著差異。5分析ColⅡ在骨折端骨痂內(nèi)的表達(dá)顯示,在骨折后第2周時(shí),DF組和DOF組ColⅡ的表達(dá)均要顯著低于CF組(P0.05),DOF組顯著低于DF組(P0.05);在骨折后第3周時(shí),DOF組ColⅡ的表達(dá)顯著低于CF組和DF組(P0.05),CF組和DF組之間無(wú)顯著差異。分析Caspase-3在骨折端骨痂內(nèi)的表達(dá)顯示,在骨折后第2周時(shí),DF組和DOF組Caspase-3的表達(dá)均顯著高于CF組(P0.05),DOF組顯著高于DF組(P0.05);第3周時(shí),DF組和DOF組Caspase-3的表達(dá)均顯著高于CF組(P0.05),DOF組與DF組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。第三部分雷奈酸鍶聯(lián)合胰島素對(duì)雙側(cè)卵巢切除2型糖尿病大鼠骨折愈合的影響目的:以2型糖尿病并雙側(cè)卵巢切除股骨閉合性骨折大鼠模型為基礎(chǔ),研究單獨(dú)應(yīng)用胰島素或聯(lián)合雷奈酸鍶治療對(duì)于其骨折愈合的影響。方法:1 80只健康雌性SD大鼠,2月齡,所有實(shí)驗(yàn)大鼠被隨機(jī)分為5組(n=16):骨折對(duì)照組(control fracture,CF)、2型糖尿病骨折組(T2DM+fracture,DF)、2型糖尿病并骨質(zhì)疏松骨折組(T2DM+Osteoporosis Fracture,DOF)、胰島素干預(yù)組(T2DM+Osteoporosis+Fracture+Insulin,DOFI)和胰島素聯(lián)合雷奈酸鍶干預(yù)組(T2DM+Osteoporosis+Fracture+Insulin+Strontium ranelate,DOFIS)。2大鼠在骨折第2、3周行X線檢查后被處死并取材。行Micro-CT檢測(cè)后,骨組織徹底脫鈣,利用番紅O-固綠染色分析骨痂內(nèi)骨性和軟骨性骨痂所占骨痂總面積的比值;利用TRAP染色,分析單位骨痂面積內(nèi)破骨細(xì)胞的數(shù)量;并利用免疫組織化學(xué)方法分析OCN、ColⅠ在骨痂內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果:1.T2DM模型建立后,DF組、DOF組、DOFI組及DOFIS組血糖均明顯高于CF組,給予胰島素干預(yù)后,DOFI組及DOFIS組血糖值趨于正常水平,并控制平穩(wěn)。2.骨折后2周時(shí),DF組和DOF組的骨折愈合X線評(píng)分均明顯低于CF組(P0.05),DF組和DOF組之間無(wú)顯著差異,DOF組、DOFI組及DOFIS組之間無(wú)顯著差異;骨折后3周時(shí),CF組、DF組、DOFI組及DOFIS組骨折愈合X線評(píng)分均顯著高于DOF組(P0.05),CF組顯著高于DF組(P0.05),而DOFI組及DOFIS組之間無(wú)顯著差異。3.Micro-CT檢測(cè)顯示,在骨折后第2周時(shí),DF組和DOF組BMD、BV,TV和BV/TV均明顯低于CF組(P0.05),DOF組BV,TV和BV/TV顯著低于DF組(P0.05),DF組和DOF組之間BMD無(wú)顯著差異;在骨折后第3周時(shí),DF組和DOF組BMD、BV和BV/TV均明顯低于CF組(P0.05),DOF組BMD、BV和BV/TV均明顯低于DF組(P0.05),CF、DF組和DOF組三組間TV無(wú)顯著差異。在骨折后第2周時(shí),DOF組、DOFI組和DOFIS組之間BMD無(wú)顯著差異,DOFI組和DOFIS組BV,TV和BV/TV顯著高于DOF組(P0.05),DOFI組和DOFIS組之間無(wú)顯著差異;在骨折后第3周時(shí),DOF組、DOFI組和DOFIS組之間TV無(wú)顯著差異,DOFI組和DOFIS組BMD、BV和BV/TV均顯著高于DOF組(P0.05),但DOFI組和DOFIS組之間無(wú)顯著差異。4.分析番紅O-固綠染色結(jié)果可見,在骨折后第2周時(shí),DF組和DOF組骨性骨痂面積比均明顯小于CF組(P0.05),DF組和DOF組之間無(wú)顯著差異,DOF組、DOFI組和DOFIS組之間無(wú)顯著差異;在骨折后第3周時(shí),DF組和DOF組骨性骨痂面積比均明顯小于CF組(P0.05),DOF組明顯小于DF組(P0.05),DOFI組和DOFIS組明顯大于DOF組(P0.05),DOFI組和DOFIS組之間無(wú)顯著差異。在骨折后第2周時(shí),DF組和DOF組軟骨性骨痂面積比均明顯小于CF組(P0.05),DOF組明顯小于DF組(P0.05),DOFI組和DOFIS組明顯大于DOF組(P0.05),DOFI組和DOFIS組之間無(wú)顯著差異;在骨折后第3周時(shí),各組間軟骨性骨痂面積比均無(wú)顯著差異。5.分析骨痂內(nèi)TRAP染色結(jié)果可見,在骨折后第2、3周,DF組和DOF組單位骨痂面積內(nèi)TRAP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞數(shù)量均明顯高于CF組(P0.05),DOF組明顯高于DF組(P0.05);在第2周時(shí),DOF組、DOFI組和DOFIS組之間單位骨痂面積內(nèi)TRAP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異,在第3周時(shí),DOFI組和DOFIS組單位骨痂面積內(nèi)TRAP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯低于DOF組(P0.05),DOFIS組明顯低于DOFI組(P0.05)。6.分析免疫組化結(jié)果可見,在骨折后第2周時(shí),DF組和DOF組OCN、Col I的表達(dá)均顯著低于CF組(P0.05),DF組和DOF組之間無(wú)明顯差異;在骨折后第3周時(shí),DF組和DOF組OCN、Col I的表達(dá)均顯著低于CF組(P0.05),DOF組顯著低于DF組(P0.05)。在骨折后第2周時(shí),DOFIS組OCN、Col I的表達(dá)均顯著高于DOF組和DOFI組(P0.05),DOF組和DOFI組之間無(wú)明顯差異;在骨折后第3周時(shí),DOFI組和DOFIS組OCN、Col I的表達(dá)均顯著高于DOF組(P0.05),DOFI組和DOFIS組之間OCN的表達(dá)無(wú)顯著差異,DOFIS組Col I的表達(dá)顯著高于DOFI組(P0.05)。結(jié)論:1.應(yīng)用高脂飼料飲食聯(lián)合低劑量STZ注射可以成功建立T2DM動(dòng)物模型,且此動(dòng)物模型符合人類T2DM發(fā)病特點(diǎn);采用骨組織影像學(xué)、組織形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)方法分析后發(fā)現(xiàn),T2DM對(duì)于骨折愈合早期階段骨痂內(nèi)的血管生成有明顯的抑制作用,這可能是其骨折愈合發(fā)生延遲的重要原因。2.在T2DM動(dòng)物模型基礎(chǔ)上行雙側(cè)卵巢切除術(shù),可使其骨折愈合早期階段的骨痂面積明顯縮小,骨痂內(nèi)新生骨質(zhì)的空間微結(jié)構(gòu)進(jìn)一步損害,骨折愈合發(fā)生延遲,這可能與其增加骨痂內(nèi)軟骨細(xì)胞凋亡,抑制其軟骨內(nèi)成骨過(guò)程有關(guān)。3.單獨(dú)胰島素治療可促進(jìn)雙側(cè)卵巢切除T2DM大鼠骨折愈合進(jìn)程,改善其骨折端骨痂內(nèi)的骨量及微結(jié)構(gòu),而其促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的作用可能是此結(jié)果的重要原因;在此基礎(chǔ)上,聯(lián)合應(yīng)用雷奈酸鍶干預(yù),雖然表現(xiàn)出可進(jìn)一步促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的作用,但是在本實(shí)驗(yàn)周期及藥物劑量的前提下,其對(duì)于骨折愈合過(guò)程和骨痂內(nèi)的骨量及微結(jié)構(gòu)并沒(méi)有明顯的改善。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.2;R580
【圖文】：

動(dòng)物自由飲食。所有實(shí)驗(yàn)大鼠被隨機(jī)分為2組（n=16）：骨折對(duì)照組（controlfracture, CF），2型糖尿病骨折組（T2DM+fracture, DF）。（實(shí)驗(yàn)流程見圖1）圖1 實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Experimental Procedures. Note: Lines: Rats in the CF group were fed anormal chow diet. Dotted lines: Rats in the experimental groups were fed ahigh-fat diet. STZ: the streptozotocin solution was injected intraperitoneally inDF group at 3 weeks. : Establish an animal model of fracture. :Animals were sacrificed.2.2 動(dòng)物處理1) 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中，CF組大鼠給予普通大鼠飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，DF組

23圖2 右側(cè)股骨干閉合性骨折動(dòng)物模型建立Fig.2 Establishment of animal model of right femoral shaft closed fracture.Note: A: Disinfection; B: Incision; C: Exposing the trochlea; D: Reaming; E:Internal fixation needle; F: Inserting the needle; G: Hammering the needle intobone; H: Suture; I: Closed fracture caused by impact.4) 術(shù)后為了預(yù)防手術(shù)傷口感染，給予大鼠肌肉注射慶大霉素3天。5) 術(shù)后即刻對(duì)大鼠右側(cè)股骨干全長(zhǎng)進(jìn)行X線檢查，確認(rèn)股骨干閉合性骨折模型建立成功與否，并留存X線片。6) 密切觀察術(shù)后大鼠身體狀況及術(shù)側(cè)后肢的日�；顒�(dòng)情況。7）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被隨機(jī)平均分為兩批，分別在骨折模型造模成功后的第2、3周，以40mg/kg給予大鼠3%戊巴比妥鈉腹腔注射行麻醉后，行右側(cè)股骨干全長(zhǎng)X線檢查，參照Chueng KM[33]和Wong E[34]的描述

2. 血清學(xué)指標(biāo)2型糖尿病動(dòng)物模型建立后，DF組血糖值于各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于CF組（圖3），DF組大鼠血中總膽固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）濃度于骨折模型建立后2周、3周均顯著高于CF組（P < 0.05）（圖4，表1）。圖3 兩組大鼠血糖變化趨勢(shì)Fig.3 Blood glucose changes of the two groups

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