【摘要】：目的:碘是人體所必需微量元素之一,但人體碘攝入過量會導致許多疾病。大量的研究表明,攝入高碘可損害甲狀腺的結構和功能,引發(fā)很多甲狀腺疾病。近年來,高碘對智力的不利影響正受到越來越多的關注,但高碘與神經毒性之間的關系存在爭議。本研究通過模擬人群高碘暴露方式構建的大鼠高碘飲水染毒模型探討高碘攝入是否會導致神經毒性及凋亡和自噬在其中的作用。方法:選擇36只健康成年SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠,雌雄比為2:1,體重210~250 g。各性別的大鼠被隨機分成4組:1個對照(自來水)組和3個碘酸鉀(Potassium iodate,KIO_3)染毒組(500、2 500、5 000μg/L KIO_3)。大鼠自由飲水進食。將各組大鼠按雌雄比2:1合籠配對,將孕鼠放置在單獨的籠子中,并保持染毒方式和劑量不變至仔鼠斷乳(出生后第21天)。斷乳后將親代和子代分開,從每組隨機挑選10只雌性仔鼠,保持染毒方式和劑量不變至仔鼠出生后第4個月末。定期記錄大鼠的體重。應用砷鈰催化分光光度法檢測4月齡雌鼠尿碘濃度,應用Morris水迷宮實驗(MWM)檢測4月齡雌鼠的學習能力和記憶能力,應用尼氏染色(Nissl staining)檢測4月齡雌鼠的海馬組織病理結構變化,應用透射電子顯微鏡(TEM)檢測4月齡雌鼠海馬組織超微結構的變化,應用檢測DNA斷裂碎片的原位末端標記實驗(TUNEL)檢測4月齡雌鼠海馬組織細胞的凋亡情況,應用蛋白免疫印跡試驗(Western blot)和免疫組化實驗(IHC)檢測凋亡關鍵分子Caspase-3、聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶(PARP)、腫瘤抑制基因蛋白P53、B淋巴細胞瘤基因-2蛋白(Bcl2)、Bcl2相關X蛋白(BAX)、細胞色素C(Cyt c)以及自噬標志蛋白微管相關蛋白輕鏈3-β(LC3)、自噬體形成關鍵蛋白Atg7和Beclin1、自噬選擇性底物蛋白P62的表達水平。結果:KIO_3暴露4個月后,尿碘檢測結果顯示,3個KIO_3染毒組4月齡雌鼠尿碘濃度明顯比對照組高(P0.05)。體重結果顯示各組4月齡雌鼠體重無顯著差異,但3個KIO_3染毒組雌鼠的腦組織臟器系數顯著低于對照組(P0.05)。水迷宮前4天的定位航行實驗(PNT)結果表明各組4月齡雌鼠的逃避潛伏期在第2-4天,3個KIO_3染毒組的4月齡雌鼠逃避潛伏期均長于對照組(P0.05);在第2-4天,3個KIO_3染毒組4月齡雌鼠游離固定平臺的距離均長于對照組(P0.05)。第5天的空間探索實驗(SPT)結果顯示,2500和5000μg/L KIO_3染毒組的4月齡雌鼠平臺穿越次數顯著低于對照組(P0.05);與對照組相比,2500和5000μg/L KIO_3染毒組的4月齡雌鼠在目標象限中花費的游泳時間/游泳距離和總的游泳時間/游泳距離的百分比顯著降低(P0.05)。尼氏染色結果顯示,各KIO_3染毒組4月齡雌鼠尼氏體數量顯著低于對照組(P0.05),并且隨著KIO_3染毒劑量的升高,4月齡雌鼠海馬CA3區(qū)中觀察到甲苯胺藍染色的尼氏體呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢。TEM檢測結果表明,與對照組相比,3個KIO_3染毒組4月齡雌鼠海馬超微結構顯示出多種異常特征,包括核染色質的均質化和邊緣化,線粒體損傷(腫脹、膜以及嵴的消失),內質網擴張,出現(xiàn)許多自噬體和神經纖維的脫髓鞘改變。TUNEL試驗檢測結果顯示2500和5000μg/LKIO_3染毒組的4月齡雌鼠海馬CA3區(qū)TUNEL陽性發(fā)生率顯著高于對照(P0.05),并且隨著染毒劑量的升高陽性率也呈現(xiàn)升高的趨勢。Western blot和IHC結果顯示,與對照組相比,2500和5000μg/LKIO_3染毒組4月齡雌鼠海馬中凋亡相關蛋白PARP,P53和Cleaved caspase-3蛋白的表達水平顯著升高(P0.05);此外,與對照組相比,2500和5000μg/LKIO_3染毒組海馬中線粒體凋亡相關蛋白Bax和Cyt c蛋白的表達水平顯著升高(P0.05),而2500和5000μg/L KIO_3染毒組4月齡雌鼠海馬中線粒體凋亡相關蛋白Bcl2蛋白的表達水平顯著下降(P0.05);與對照組相比,2500和5000μg/LKIO_3染毒組4月齡雌鼠海馬中自噬形成關鍵蛋白Atg7、Beclin1和自噬體標志蛋白LC3-II表達水平均顯著升高(P0.05),2500和5000μg/LKIO_3染毒組4月齡雌鼠海馬中自噬底物蛋白p62表達水平也顯著升高(P0.05)。結論:高碘暴露會導致4月齡雌鼠的學習能力和記憶能力下降,損傷大鼠海馬組織結構。同時,高碘暴露會導致大鼠海馬發(fā)生凋亡和自噬流紊亂;線粒體凋亡途徑參與了高碘誘導的細胞凋亡,而自噬流紊亂是由自噬體形成的增加和降解的減少所誘導。綜上,凋亡和自噬流紊亂參與了高碘致SD大鼠神經毒性的損傷過程。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R595
【圖文】：

圖 2 高碘對大鼠記憶能力的影響（n = 6）：（A）SPT 中的穿環(huán)次數；（B）SPT 中在目標象限所花費的時間與總時間的分比；（C）SPT 中在目標象限的花費的路程與總路程的百分比；（D）SPT 中 4 月齡雌鼠的游泳軌跡。*表示與對照組相比，P<0.05。.4 高碘對大鼠海馬組織中尼氏體數量的影響從每組隨機選 3 只雌性大鼠使用尼氏染色法研究高碘對大鼠海馬組織 CA3域中尼氏體的影響。選擇海馬組織 CA3 區(qū)域中尼氏體的 IOD 值作為參數指標反映海馬 CA3 區(qū)域中尼氏體的數量。結果表明，與對照組相比，500、2500 5000 μg/L 3 個 KIO3染毒組 4 月齡雌鼠海馬組織中尼氏體數量明顯減少P<0.05），且隨著攝碘濃度的升高，尼氏體數量也呈下降趨勢（如圖 3A~I）。

圖 3 高碘對大鼠海馬組織中尼氏小體數量的影響（n=3）（A-D）海馬組織 CA3 區(qū)域尼氏染色（200 倍）；（E-H）海馬組織 CA3 區(qū)域染色（400 倍）；（I）尼氏體 IOD 值的定量分析。*與對照組相比，P<0.05。 高碘對大鼠海馬組織超微結構的影響從每組中隨機選擇 3 只雌性大鼠通過 TEM 檢測大鼠海馬組織 CA3 區(qū)域中結構的改變。結果表明，與對照組相比，500、2500 和 5000 μg/L 3 個 KIO3組 4 月齡雌鼠呈現(xiàn)出多種異常特征。在 500 μg/LKIO3染毒組 4 月齡雌鼠�？� CA3 區(qū)域中，觀察到大量細胞凋亡的形態(tài)學特征，包括核染色質的均質邊緣化，還觀察到少量的自噬體（含有線粒體或其他細胞質內容物的雙膜）和腫脹的線粒體（如圖 4B 和 F）。在 2500 μg/L KIO3染毒組 4 月齡雌鼠海織 CA3 區(qū)域中，可觀察到許多自噬體、膜消失的線粒體和神經纖維的脫髓變（圖 4C 和 G）。在 5000 μg/L KIO3染毒組 4 月齡雌鼠海馬組織 CA3 區(qū)域觀察到了更嚴重的改變，包括內質網擴張，線粒體腫脹以及線粒體嵴的消圖 4D 和 H）。

圖 4 高碘對大鼠海馬組織超微結構的影響（n=3）注：黑色粗體箭頭表示自噬體；黑色細箭頭表明示內質網擴張、腫脹；白色粗體箭頭表示線粒體腫脹、嵴消失；白色細箭頭表示神經纖維脫髓鞘；井號表示核染色質的均質化；星號表示包括核染色質的均質和邊緣化。2.6 高碘對大鼠海馬神經元細胞凋亡的影響從每組中隨機選擇 3 只雌性大鼠使用 TUNEL 試驗檢測雌性大鼠海馬 CA3區(qū)域神經元細胞的早期凋亡情況，TUNEL 是通過檢測細胞發(fā)生凋亡后細胞中出現(xiàn)的 DNA 斷裂碎片（染色后呈棕黃色）間接反映細胞凋亡情況。結果顯示，對照組 4 月齡雌鼠海馬 CA3 區(qū)域中 TUNEL 陽性的神經元細胞很少幾乎看不到，而 2500 和 5000μg/L KIO3染毒組 4 月齡雌鼠海馬 CA3 區(qū)域中 TUNEL 陽性的神經元細胞數量較多，明顯要多于對照組（如圖 5）。

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