【摘要】：目的:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種以自身抗體產(chǎn)生和多器官受損為特征的自身免疫性疾病,其病理機(jī)制的核心是機(jī)體對(duì)自身抗原的免疫耐受打破,大量針對(duì)自身抗原的B細(xì)胞過(guò)度活化并分泌大量自身抗體。而導(dǎo)致B細(xì)胞功能異常的具體機(jī)制仍不清楚。脂筏(Lipid Rafts,LRs)是細(xì)胞膜中富含膽固醇和鞘磷脂(Sphingomyelin,SM)的功能微區(qū),可以參與淋巴細(xì)胞的活化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)功能。鞘磷脂合成酶1(Sphingomyelin synthase 1,SMS1)是SM合成的關(guān)鍵酶,近年來(lái)隨著對(duì)脂質(zhì)的研究,其多種生物學(xué)功能逐漸被發(fā)現(xiàn)。探討SMS1-SM在B細(xì)胞活化中的作用有望為SLE探尋新的干預(yù)靶點(diǎn)提供依據(jù),因此本研究旨在闡明SMS1-SM在B細(xì)胞功能及SLE疾病進(jìn)展中的作用及機(jī)制。方法:1.納入性別及年齡匹配的SLE患者及正常志愿者,磁珠分選獲得SLE患者及正常志愿者外周循環(huán)的B淋巴細(xì)胞,RT-PCR技術(shù)分析B細(xì)胞SMS1的mRNA表達(dá)水平,CBA法檢測(cè)納入者血清細(xì)胞因子譜的水平,將以上指標(biāo)與其他實(shí)驗(yàn)室檢查、疾病活動(dòng)度評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析。2.磁珠分選獲得SMS1-/-和WT小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞,進(jìn)行體外刺激活化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B細(xì)胞的活化、增殖及分化水平,Western Blot檢測(cè)BCR活化時(shí)下游信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白分子的磷酸化水平。3.以Bm12小鼠作為供者小鼠,將性別和年齡匹配的SMS1-/-和WT小鼠分別作為受者,構(gòu)建cGVHD模型以模擬SLE的病理狀態(tài)。造模前以及造模后每2周收集小鼠的血清標(biāo)本及尿標(biāo)本。在誘導(dǎo)4周后,ELISA檢測(cè)小鼠血清ANA的滴度,比色法檢測(cè)小鼠尿肌酐水平,BCA法檢測(cè)小鼠尿蛋白的水平;同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的活化狀態(tài)。另外,磁珠分選得到WT小鼠脾臟來(lái)源的功能正常的B細(xì)胞,分別對(duì)SMS1-/-和WT小鼠進(jìn)行尾靜脈過(guò)繼轉(zhuǎn)輸,轉(zhuǎn)輸后再進(jìn)行cGVHD模型的誘導(dǎo),觀察以上指標(biāo)的變化。4.利用pristane腹腔注射對(duì)SMS1-/-和WT小鼠誘導(dǎo)SLE模型,造模周期為6個(gè)月,評(píng)估SMS1缺陷對(duì)模型小鼠自身抗體滴度、腎臟病理?yè)p傷及評(píng)分、IgG沉積及B細(xì)胞活化功能的影響。結(jié)果:1.SLE患者B淋巴細(xì)胞SMS1mRNA表達(dá)水平顯著升高,與血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-12和IL-23均呈顯著正相關(guān);同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)SMS1 mRNA水平與血清IgG和球蛋白滴度也有顯著的正相關(guān)性,但與SLEDAI評(píng)分沒(méi)有明顯的相關(guān)性。2.SMS1-/-小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞在體外刺激活化后,其CD69、CD80和CD86的表達(dá)顯著低于WT組,但細(xì)胞表面GM1的水平與WT組沒(méi)有顯著差異;同時(shí)SMS1-/-的B細(xì)胞的BCR信號(hào)通路中Fyn和Syk的磷酸化水平明顯弱于WT組;此外,SMS1-/-B細(xì)胞的增殖和分化水平也受到抑制。3.Bm12誘導(dǎo)的cGVHD模型在造模4周后,SMS1-/-小鼠血清ANA滴度和24小時(shí)尿蛋白排泄量顯著低于WT組,其脾臟B細(xì)胞上CD69、CD80和CD86的表達(dá)低于WT組。而SMS1-/-小鼠在過(guò)繼轉(zhuǎn)輸功能正常的B細(xì)胞后再進(jìn)行cGVHD模型的誘導(dǎo),可以加劇血清中ANA和24小時(shí)尿蛋白的產(chǎn)生,同時(shí)B細(xì)胞的活化也得到部分糾正。4.在pristane誘導(dǎo)的SLE模型中,同樣發(fā)現(xiàn)SMS1缺陷可以顯著降低自身抗體ANA、anti-dsDNA的滴度,降低腎臟的病理評(píng)分及IgG的沉積,而SMS1-/-組模型疾病表現(xiàn)的改善同樣與抑制B細(xì)胞過(guò)度活化相關(guān)。結(jié)論:SMS1是參與B淋巴細(xì)胞活化的重要組分,可以通過(guò)影響B(tài)細(xì)胞的功能參與SLE的疾病進(jìn)展,有望成為SLE治療的新的潛在靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R593.241
【圖文】：

磁珠分選外周血中B細(xì)胞，流式檢測(cè)B細(xì)胞純度

圖 3：SLE 患者于正常對(duì)照組（HC）血漿中細(xì)胞因子的水平。CBA 方法檢測(cè)納入者血清中 IL-1β、IFN-α、IFN-γ、TNF-α、CCL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18 和 IL-23 的表達(dá)水平，N(SLE)=21，N(HC)=15。三、 SMS1mRNA、細(xì)胞因子與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及疾病活動(dòng)度 SLEDAI 評(píng)分之間的相關(guān)性分析。1. B 細(xì)胞 SMS1 的表達(dá)水平與細(xì)胞因子譜的相關(guān)性分析SLE 患者血漿或血清中存在多種細(xì)胞因子水平的異常，已有的研究指出 IFN-α、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18 和 IL-23 等細(xì)胞因子均可能存在異常，雖然部分研究的結(jié)果及結(jié)論并非一致，但目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞因子的水平可以一定程度地反映疾病的活動(dòng)狀態(tài)。

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本文編號(hào)：2741310