【摘要】：Ⅱ型糖尿病(T2DM)是嚴重影響身體健康、對家庭經(jīng)濟造成多重影響的一種慢性疾病。當前越來越多的證據(jù)表明,T2DM可以增加患癌的風險及癌癥差的預后。然而,人們對T2DM與癌癥之間的生物學聯(lián)系,和T2DM引發(fā)癌癥的分子機制還知之甚少。中心體擴增已被證實是腫瘤的特征之一,并且中心體擴增可以誘導癌癥的發(fā)生,增加腫瘤細胞的侵襲能力。同時,也與較差的癌癥預后相關。可是,關于T2DM是否通過中心體擴增而引發(fā)癌癥的研究,截至目前為止尚未見報道;而且T2DM是否引起中心體擴增,以及造成中心體擴增的分子機制研究也不清楚。本學位論文研究了體外模擬T2DM的病理生理條件,使用功能蛋白質組學、分子生物學和細胞生物學相關技術與手段,尋找T2DM引起中心體擴增的相關蛋白分子以及相關信號通路。驗證了在腦膠質瘤細胞中,同樣發(fā)生了中心體擴增,并且與腦膠質瘤的分期相關。研究內(nèi)容包含以下四個部分:第一部分:利用功能蛋白質組學方法研究Ⅱ型糖尿病引起中心體擴增的分子機制。最近研究報道,在結直腸癌HCT116細胞株中,T2DM通過增強ROCK1/14-3-3σ復合體的表達、綁定和中心體移位來促進中心體擴增。使用功能蛋白質組學研究策略,利用HCT116細胞,進一步研究了中心體擴增的分子信號通路。以未處理的HCT116細胞為對照組,高糖、高脂、高胰島素的體外模擬T2DM的病理生理條件的HCT116細胞為處理組。使用免疫熒光法檢測了兩種類型組別細胞中心體的擴增情況。結果顯示,在處理組細胞中,發(fā)生了中度(3-5個)中心體擴增;使用2-DE方法分析了兩種類型組別細胞的蛋白差異點。結果顯示,與對照組相比,處理組出現(xiàn)了9個差異蛋白,其中7個上調,2個下調;用多肽指紋圖譜法鑒定了9個蛋白的身份。蛋白免疫印跡法檢測了NPM、PCNA和14-3-3σ的蛋白表達,結果和2-DE的相符。進一步使用免疫熒光和蛋白質免疫印跡法,檢測了NPM、PCNA和14-3-3σ之間的相關性。結果顯示,NPM獨自引起中心體擴增,PCNA通過ROCK1調控中心體擴增。以上研究表明,在高糖、高脂、高胰島素的條件下,NPM活性增加可以誘導中心體擴增;同時PCNA和14-3-3σ表達增強,增強了中心體的擴增。第二部分:JNK1/Stat3信號通路負向調控中心體擴增。中心體擴增可以誘導癌癥的發(fā)生,增加腫瘤細胞的侵襲能力。那么,是否存在在T2DM的病理生理條件下的負向調控機制呢?鑒于此,使用蛋白質免疫印跡法,檢測了對照組和處理組兩組細胞中JNK1和Stat3活性情況。結果顯示,在高糖、高脂、高胰島素條件下,JNK1和Stat3活性均被激活;通過JNK1和Stat3的沉默實驗發(fā)現(xiàn),在處理組中,兩個蛋白被敲低之后均上調了中心體的擴增;此外,構建了pcDNA3.1(+)-JNK1的真核表達載體,轉染細胞后發(fā)現(xiàn),處理組中JNK1的過表達下調了中心體的擴增;同時,使用蛋白質免疫印跡法,檢測了JNK1和Stat3上下游之間的關系發(fā)現(xiàn),JNK1是Stat3的上游效應分子;進一步研究發(fā)現(xiàn),JNK1和Stat3均影響了14-3-3σ的表達,從而影響中心體擴增。以上研究表明,高糖、高脂、高胰島素激活了JNK1-Stat3的信號通路,調控了下游效應分子14-3-3σ,從而調控了細胞的中心體擴增,為進一步的癌癥預防奠定了理論基礎。第三部分:Hsp74/14-3-3σ復合體介導中心體擴增。功能蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn),T2DM通過增強14-3-3σ的表達來促進中心體擴增,而JNK1-Stat3也通過14-3-3σ負向調控了中心體擴增。在本研究中,進一步研究了T2DM在生理病理條件下,14-3-3σ的特征及其相互作用的蛋白質。采用免疫共沉淀聯(lián)合質譜分析,確認了與14-3-3σ互作的134個蛋白質,其中包括70kDa熱休克蛋白4(Hsp74)。GO分析顯示,這些蛋白質中有許多具有豐富的結合活性。KEGG分析顯示,處于前3位的富集途徑為核糖體、碳代謝和氨基酸生物合成。分子和功能的研究揭示,實驗處理后增加了14-3-3σ/Hsp74的表達和綁定以及中心體擴增。但是,使用siRNA-14-3-3σ和siRNA-Hsp74處理后,抑制了處理組增加的表達、綁定和中心體擴增。此外,分子對接分析表明,14-3-3σ/Hsp74相互作用,主要是通過疏水作用力和一個較小程度上離子鍵和氫鍵。總之,研究結果表明,T2DM通過14-3-3σ和Hsp74的表達和綁定引起了中心體擴增。第四部分:腦膠質瘤中心體的異常擴增及其和疾病分期的相關性。研究報道,在各種類型的腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了中心體擴增。但是,關于中心體擴增與腦膠質瘤的關系及其與疾病分期的相關報道還很少。因此,本研究使用HE染色法,將收集到的40例膠質瘤標本和10例正常腦組織標本進行分級;使用免疫組織化學法檢測了Ki67和γ-tubulin蛋白表達。結果表明,Ki67在正常腦組織中沒有表達,但在/級、級和V級中,陽性表達率分別為65%、80%和100%,各組間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),說明Ki67的表達與膠質瘤級別相關;同時,g-tubulin蛋白在各個標本中的表達率分別為:30%、50%、80%和100%,各組間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),說明膠質瘤級別升高,中心體擴增率增加;使用免疫熒光檢測各級別組織標本發(fā)現(xiàn),中心體擴增率和腦膠質瘤的級別呈正相關�？偠灾�,中心體擴增是腦膠質瘤的惡性程度的特征之一,并且與膠質瘤發(fā)病階段有關,提示中心體擴增和腦膠質瘤的發(fā)展具有密切的相關性。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),T2DM的病理生理條件引起了細胞中心體的擴增,且揭示了相關的分子機制;在腦膠質瘤中不但發(fā)現(xiàn)了中心體的擴增,而且還和疾病的分期相關。因此,中心體擴增分子機制的發(fā)現(xiàn),將有助于開發(fā)抑制T2DM引起中心體擴增的方法。本研究有助于闡明T2DM引起中心體擴增的分子機制,但對于是否對癌癥的發(fā)生有促進作用尚待探索。如果是這樣,那么抑制中心體擴增對T2DM患者的癌癥預防將具有非常重要的意義。
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.1
【圖文】：

2圖 1.1 中心體的結構[6]A：中心體結構模式圖；B：電鏡下的中心體結構Fig. 1.1 The structure of centrosomeA: Schematic picture of centrosome; B: Electron micrograph of centrosome1.2 中心體的復制眾所周知，在有絲分裂的過程中，染色體總是忠實的分離到兩個子細胞中，這對于維持大多數(shù)（不是所有）生物體的遺傳穩(wěn)定性是至關重要的[7]。中心體和有絲分裂微管之間的相互作用導致了染色體精確地分離到兩個子細胞中。細胞分裂后每個子細胞中只含有一個中心體；就像 DNA 一樣，中心體在每個細胞周期中只能復制一次。中心體復制必須嚴格控制，因為每個母中心粒產(chǎn)生一個以上的中心粒就會導致中心體擴增的出現(xiàn)，從而導致細胞遺傳物質的不穩(wěn)定。對于中心體復制周期的觀察，最早是通過電子顯微鏡確定的，根據(jù)細胞周期中中心粒對的形態(tài)來確定中心體復制周期。近年來，在非洲爪蟾蜍卵提取物和培養(yǎng)的哺乳動物

維連接兩個姐妹染色單體的著絲粒）是錯誤的連接狀態(tài)（圖 1.2）。由于缺少連接以及姐妹著絲粒間缺少張力，syntely 和 monotely 連接方式激活了 SAC。如果完成了所有著絲粒的連接，滿足了 SAC 的檢測，則會啟動有絲分裂的后期[24]。先前 Vogelstein 等人為了檢測染色體不穩(wěn)定性的結直腸癌細胞系中 SAC 的保真度，使用諾考達唑干擾微管，來測定這些細胞的有絲分裂指數(shù)。結果證明，在諾考達唑引起染色體不穩(wěn)定性的結腸直腸癌細胞系中，染色體不穩(wěn)定性不會引起明顯的有絲分裂阻滯，提示染色體不穩(wěn)定性細胞缺乏一個積極檢測的 SAC[25]。但是，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，染色體不穩(wěn)定性細胞常表現(xiàn)為染色體滯后和后期橋接[26]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這些表型是另一種錯誤的微管-著絲粒連接類型（merotely）引起的。Merotely 是紡錘體兩極的微管纖維連接一個著絲粒，重要的是，由于微管纖維連接到所有的著絲粒上，產(chǎn)生了足夠的張力，造成了 SAC 并沒有檢測到這個錯誤連接（圖 1.2）。微管連接著絲粒是一個高度動態(tài)的過程，依賴于著絲粒與中心體核化的微管之間的距離[27]。這導致額外的中心體和/或染色體的存在延長了紡錘體組裝的過程[28]。

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1 焦立新;;1例BX亞型的分子機制研究[J];中國輸血雜志;2010年S1期

2 ;國家自然科學基金委員會生命科學部2018年度青年科學基金項目[J];生命科學;2018年12期

3 張琦;朱耐偉;朱勇U

本文編號：2728400