【摘要】：目的:動脈粥樣硬化是2型糖尿病大血管病變的病理基礎(chǔ),而啟動動脈粥樣硬化早期改變的就是血管內(nèi)皮功能異常,內(nèi)皮功能異常的表現(xiàn)之一就是遷移功能的變化。T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結(jié)構(gòu)域因子3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecule 3,Tim3)是表達于內(nèi)皮細胞的一種糖蛋白,與內(nèi)皮細胞移動變化的相關(guān)性目前未見報道。本研究目的就是確定Tim3蛋白在不同葡萄糖濃度下是否對內(nèi)皮細胞遷移功能產(chǎn)生影響。方法:以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)為研究對象,應(yīng)用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù),阻斷內(nèi)皮細胞Tim3蛋白表達,并在不同葡萄糖濃度下對細胞進行培養(yǎng)。在本研究中,實驗分為三大組:正常對照組,si-Tim3干擾組,si-Tim3無效干擾組。三組細胞分別在正常培養(yǎng)基及賦糖培養(yǎng)基(5.5mmol/L葡萄糖或60mmol/L葡萄糖)中培養(yǎng)24h、48h、72h。顯微鏡下觀察各組細胞不同時間點細胞形態(tài)及細胞遷移變化。應(yīng)用劃痕及Transwell實驗評估細胞遷移功能的變化,并計算培養(yǎng)72h細胞的細胞遷移率和遷移數(shù)量。同時收集培養(yǎng)72h細胞,通過Real-time PCR、Western blot分別檢測Tim3及與細胞遷移能力相關(guān)的標(biāo)志蛋白(E-cadherin、α-catenin、Vimentin和ZEB1)的mRNA與蛋白表達水平,并分別應(yīng)用2~(-△△CT)方法和凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)對其進行半定量分析。結(jié)果:1.細胞形態(tài)正常培養(yǎng)下,正常對照組及Tim3無效干擾組細胞排列整齊,形態(tài)正常;而Tim3干擾組細胞則排列紊亂、不規(guī)則細胞比例增多。賦糖培養(yǎng)下,當(dāng)糖濃度為5.5mmol/L時,各組細胞形態(tài)與在正常培養(yǎng)下的各對應(yīng)細胞組相似;在糖濃度為60mmol/L時,正常細胞組的細胞形態(tài)也出現(xiàn)異常,Tim3干擾組細胞排列紊亂進一步加重。2.細胞遷移變化2.1劃痕實驗:正常培養(yǎng)下,正常對照組遷移率為82.85±3.75%,無效干擾組細胞遷移率為82.57±2.15%,Tim3干擾組細胞遷移率為60.37±7.86%,與正常對照組相比明顯降低(P0.05)。賦糖培養(yǎng)下,在糖濃度為5.5mmol/L時,正常細胞組、Tim3無效干擾組、Tim3干擾組細胞遷移率分別為82.34±3.52%、79.13±4.91%、65.13±4.08%,與正常培養(yǎng)下的各對應(yīng)細胞組一致;在糖濃度為60mmol/L時,上述三組細胞遷移率分別為61.36±7.42%、61.24±7.17%、35.58±5.25%,Tim3干擾組細胞遷移率顯著低于正常細胞組(P0.05),此條件下培養(yǎng)的三組細胞遷移率均明顯低于正常培養(yǎng)下各對應(yīng)細胞組的細胞遷移率。2.2 Transwell實驗:通過遷移細胞數(shù)量來反應(yīng)細胞移動能力。正常培養(yǎng)下,正常對照組遷移細胞數(shù)為144±16個,Tim3干擾組遷移細胞數(shù)為53±7個,兩組相比差異顯著(P0.05)。Tim3無效干擾組遷移細胞數(shù)與正常對照組接近,為148±16個。賦糖培養(yǎng)下,在糖濃度為5.5mmol/L時,正常細胞組、Tim3無效干擾組、Tim3干擾組遷移細胞數(shù)分別為127±14、134±20、52±8個,與正常培養(yǎng)下的各組情況相似;在糖濃度為60mmol/L時,正常細胞組遷移細胞數(shù)為56±8個,Tim3無效干擾組遷移細胞數(shù)為52±5個,Tim3干擾組遷移細胞數(shù)為19±4個,較正常細胞組顯著減少(P0.05);此條件培養(yǎng)下的三組細胞遷移數(shù)均明顯低于正常培養(yǎng)下各對應(yīng)細胞組的細胞遷移數(shù)。3.移動標(biāo)志相關(guān)蛋白的mRNA表達水平變化本研究檢測了如下四種蛋白:E-cadherin、α-catenin、Vimentin和ZEB1。正常培養(yǎng)下,正常對照組E-cadherin、α-catenin mRNA表達水平分別為1.00±0.06和1.00±0.05,Vimentin和ZEB1 m RNA表達水平分別為1.00±0.05和1.00±0.10。Tim3無效干擾組上述各蛋白mRNA表達水平分別為1.13±0.07、0.93±0.06、0.98±0.05和0.92±0.07。Tim3干擾組各蛋白的mRNA表達水平則分別為2.78±0.29、3.35±0.14、0.44±0.02、0.67±0.02,與正常對照組相比,E-cadherin、α-catenin mRNA表達水平顯著增高,而Vimentin和ZEB1 m RNA表達水平顯著下降(P0.05);進行賦糖培養(yǎng),糖濃度為5.5mmol/L時,各蛋白mRNA表達水平與正常培養(yǎng)下各對應(yīng)細胞組相似;在糖濃度為60mmol/L時,正常細胞組E-cadherin和α-catenin mRNA表達水平分別為3.25±0.11和4.23±0.33,Vimentin和ZEB1mRNA表達水平分別為0.37±0.03和0.49±0.03。無效干擾組E-cadherin、α-catenin mRNA表達水平分別為3.12±0.24和3.96±0.13,Vimentin和ZEB1mRNA表達水平分別為0.36±0.02和0.49±0.04,與正常細胞組相比無明顯差異。Tim3干擾組E-cadherin、α-catenin mRNA表達水平分別為4.25±0.29和5.34±0.12,Vimentin和ZEB1mRNA表達水平分別為0.22±0.01和0.18±0.01,與正常細胞組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。上述四種蛋白mRNA表達水平與正常培養(yǎng)下各對應(yīng)細胞組相比,E-cadherin和α-catenin明顯增高,Vimentin和ZEB1明顯下降,在Tim3干擾組表現(xiàn)更為明顯,組間比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.移動標(biāo)志相關(guān)蛋白水平變化本研究檢測了如下四種蛋白:E-cadherin、α-catenin、Vimentin和ZEB1。正常培養(yǎng)下,正常對照組E-cadherin、α-catenin蛋白表達水平分別為1.00±0.07和1.00±0.13,Vimentin和ZEB1蛋白表達水平分別為1.00±0.07和1.00±0.05。Tim3無效干擾組上述各蛋白表達水平分別為0.97±0.11、1.13±0.13、1.06±0.09和0.93±0.09。Tim3干擾組各蛋白的表達水平則分別為2.43±0.24、3.72±0.33、0.35±0.05和0.41±0.03,與正常對照組相比,E-cadherin、α-catenin蛋白表達水平顯著增高,而Vimentin和ZEB1表達水平顯著下降(P0.05);進行賦糖培養(yǎng),在糖濃度為5.5mmol/L時,各蛋白表達水平與正常培養(yǎng)下各對應(yīng)細胞組相似;在糖濃度為60mmol/L時,正常細胞組E-cadherin、α-catenin蛋白表達水平分別為2.34±0.11和3.65±0.23,Vimentin和ZEB1表達水平分別為0.37±0.04和0.40±0.04。無效干擾組E-cadherin、α-catenin蛋白表達水平分別為2.38±0.14和3.68±0.24,Vimentin和ZEB1表達水平分別為0.36±0.07和0.36±0.04,與正常細胞組相比無明顯差異。Tim3干擾組E-cadherin、α-catenin蛋白表達水平分別為4.67±0.36和6.20±0.42,Vimentin和ZEB1表達水平分別為0.24±0.03和0.12±0.02,與正常細胞組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。上述四種蛋白表達水平與正常培養(yǎng)下各對應(yīng)細胞組相比,E-cadherin、α-catenin明顯增高,而Vimentin和ZEB1明顯下降,在Tim3干擾組表現(xiàn)更為明顯,組間比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、Tim3蛋白和高糖均與血管內(nèi)皮細胞的遷移功能有關(guān),在高糖或Tim3蛋白表達下降時,內(nèi)皮細胞的遷移能力降低。2、Tim3對內(nèi)皮細胞遷移的影響?yīng)毩⒂谄咸烟亲饔?但兩者存在疊加作用,在高糖環(huán)境下阻斷Tim3蛋白會加重血管內(nèi)皮遷移功能的損傷。
【圖文】：

21圖 1. RNA 干擾后各組 Tim3 mRNA 表達水平對照組、NC 為無效干擾序列組、siRNA-1、siR列組（與正常對照組相比 , **P＜0.01；與 siRN

圖 2 Western blot 檢測 Tim3 蛋白表達水平：Control 為正常對照組、NC 為無效干擾組、siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3別為 3 條干擾序列組（與正常對照組相比，**P＜0.01；與 siRNA-1 比較，，#P＜0.01）
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2

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本文編號：2704513