【摘要】：目的:鹽酸益母草堿是一種提取自細(xì)葉益母草的鹽酸鹽水合物,根據(jù)之前的研究,鹽酸益母草堿具有多種的藥用價(jià)值,主要集中在婦產(chǎn)科疾病治療方面以及最新的心腦血管系統(tǒng)疾病診治方面。有實(shí)驗(yàn)初步證明鹽酸益母草堿對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松有緩解作用,相關(guān)機(jī)制是通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的增殖與分化而實(shí)現(xiàn),但鹽酸益母草堿對(duì)成骨細(xì)胞的具體相關(guān)機(jī)制尚未開(kāi)展研究。本研究首次通過(guò)多種體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)方法研究鹽酸益母草堿對(duì)成骨細(xì)胞的作用,并探討可能存在的相關(guān)機(jī)制。研究方法:1、8周齡的雌性C57BL/6小鼠,體重在19-22克之間,在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院本溪實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)間進(jìn)行飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,將小鼠隨機(jī)分為三組,每組均為6只,分別為假手術(shù)組,骨質(zhì)疏松模型組,骨質(zhì)疏松模型+鹽酸益母草堿干預(yù)組。其中假手術(shù)組打開(kāi)腹腔后,無(wú)任何其他操作僅將腹膜以及皮膚進(jìn)行縫合。骨質(zhì)疏松模型組與骨質(zhì)疏松模型+鹽酸益母草堿干預(yù)組小鼠,打開(kāi)腹腔后將雙側(cè)卵巢用6-0線進(jìn)行結(jié)扎摘除,而后進(jìn)行腹膜及皮膚縫合。術(shù)后一周骨質(zhì)疏松模型+鹽酸益母草堿干預(yù)組給予腹腔注射鹽酸益母草堿,劑量為15mg/Kg/d,假手術(shù)組與骨質(zhì)疏松模型組僅給予相同量的生理鹽水腹腔注射。干預(yù)8周后,進(jìn)行骨密度檢測(cè)后,進(jìn)行取材,選取股骨遠(yuǎn)端與脛骨近端骨組織以及外周血進(jìn)行檢測(cè)。2、通過(guò)對(duì)股骨遠(yuǎn)端骨組織進(jìn)行病理組織切片,用HE染色法檢測(cè)股骨遠(yuǎn)端干骺端骨小梁的大體結(jié)構(gòu),并對(duì)組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè),分別檢測(cè)成骨分化蛋白R(shí)unx2以及Wnt/β-catenin通路下游蛋白β-catenin的體內(nèi)骨骼組織中的表達(dá)情況。3、采用X線以及micro-CT方法檢測(cè)小鼠骨密度以及骨微結(jié)構(gòu)的改變情況。4、應(yīng)用ELISA方法以及專(zhuān)用試劑盒,對(duì)采集的小鼠外周血進(jìn)行骨鈣素以及堿性磷酸酶的檢測(cè)。5、利用CCK-8比色法檢測(cè)鹽酸益母草堿在體外對(duì)小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1的細(xì)胞活力影響作用。6、采用堿性磷酸酶染色以及茜素紅染色檢測(cè)鹽酸益母草堿對(duì)小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1分化以及礦化的作用。7、運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)鹽酸益母草堿對(duì)體外小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1的影響作用,主要指標(biāo)包括Wnt/β-catenin通路一些關(guān)鍵蛋白(LRP5、GSK-3β、β-catenin)的mRNA表達(dá)情況,以及成骨細(xì)胞分化(ALP、Runx2、Osterix、Col1-α1)和骨成熟蛋白(OPG)的相關(guān)重要mRNA表達(dá)情況。8、運(yùn)用蛋白免疫印跡法(Western blot法)檢測(cè)成骨細(xì)胞分化蛋白R(shí)unx2以及Wnt/β-catenin通路下游β-catenin以及磷酸化GSK-3β的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1、骨質(zhì)疏松造模組骨密度較正常對(duì)照組骨密度顯著降低(P0.01),骨質(zhì)疏松造模組+鹽酸益母草堿較單純骨質(zhì)疏松造模組骨密度顯著提升(P0.01)。2、與假手術(shù)組相比,骨質(zhì)疏松造模組小鼠血清中骨鈣素(OCN)顯著降低(P0.01);較單純骨質(zhì)疏松造模組,骨質(zhì)疏松造模+鹽酸益母草堿組小鼠血清中骨鈣素有所提升(P0.01)。與此相似的結(jié)果,骨質(zhì)疏松造模組小鼠血清中堿性磷酸酶(ALP)水平較假手術(shù)組與骨質(zhì)疏松造模+鹽酸益母草堿組都明顯降低(P0.01),鹽酸益母草堿可以明顯提升骨質(zhì)疏松小鼠體內(nèi)堿性磷酸酶的表達(dá)(P0.01)。3、HE染色發(fā)現(xiàn)原發(fā)性骨質(zhì)疏松小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁數(shù)量與寬度明顯減少,間隔明顯加大。鹽酸益母草堿干預(yù)后可以使骨小梁稀疏程度明顯改善。4、免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示,與假手術(shù)組比較,骨質(zhì)疏松造模組β-catenin與Runx2股骨遠(yuǎn)端骨骼組織病理切片中表達(dá)顯著降低(P0.01)。但骨質(zhì)疏松造模+鹽酸益母草堿組較骨質(zhì)疏松組β-catenin與Runx2明顯表達(dá)增多(P0.01)。5、Micro-CT檢測(cè)脛骨近端骨微結(jié)構(gòu)顯示,與假手術(shù)組相比,骨質(zhì)疏松模型組在骨小梁與總體積百分比(P0.01)、骨小梁面積與骨小梁體積百分比(P0.01)、骨小梁的寬度(P0.05)與數(shù)量上均明顯下降(P0.01),骨小梁的間隔寬度顯著上升(P0.01);而骨質(zhì)疏松模型+鹽酸益母草堿組,較骨質(zhì)疏松造模組比較,鹽酸益母草堿干預(yù)后顯著提升了骨小梁體積百分比與骨小梁的數(shù)量(P0.01),降低了骨小梁的間隔(P0.05)。6、通過(guò)CCK-8檢測(cè)鹽酸益母草堿對(duì)體外小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1的活力影響,顯示100μmmol/L以下濃度的鹽酸益母草堿對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯影響,100μmmol/L濃度,造成MC3T3-E1增殖速度明顯下降(P0.01)。7、堿性磷酸酶以及茜素紅染色顯示,鹽酸益母草堿(濃度為10μmmol/L,1μmmol/L)可以明顯促進(jìn)體外MC3T3-E1細(xì)胞的堿性磷酸酶分泌及鈣化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生。同時(shí)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞干預(yù)鹽酸益母草堿1天與5天后的堿性磷酸酶濃度進(jìn)行檢測(cè),顯示干預(yù)1天各組之間堿性磷酸酶濃度并無(wú)明顯差異,干預(yù)5天后10μmmol/L,1μmmol/L的益母草堿干預(yù)組堿性磷酸酶表達(dá)量顯著提升,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分別為(P0.01,P0.05)。8、RT-PCR檢測(cè)顯示給予體外MC3T3-E1細(xì)胞鹽酸益母草堿干預(yù)后,濃度為10μmmol/L的益母草堿干預(yù)組Wnt通路中相關(guān)重要節(jié)點(diǎn)基因LRP5、β-catenin的mRNA表達(dá)量顯著上升,不同濃度的益母草堿(濃度為10μmmol/L,1μmmol/L,0.1μmmol/L)干預(yù)后,有提示成骨分化的基因(ALP、unx2、Osterix、Col1-α1)不同程度地表達(dá)升高,而顯示骨成熟的基因OPG(骨保護(hù)素)不同濃度的益母草堿干預(yù)后表達(dá)亦表達(dá)升高。9、與假手術(shù)組相比,給予鹽酸益母草堿干預(yù)后,MC3T3-E1細(xì)胞系表達(dá)Wnt通路下游關(guān)鍵蛋白β-catenin以及磷酸化的p-GSK-3β明顯升高(10μmmol/L,1μmmol/L,P0.01),總GSK-3β表達(dá)無(wú)明顯差異。成骨分化重要蛋白R(shí)unx2表達(dá)顯著升高(10μmmol/L,1μmmol/L,0.1μmmol/L,P0.05)。結(jié)論:1、鹽酸益母草堿可以顯著提高原發(fā)性骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度值。2、鹽酸益母草堿可以明顯增加原發(fā)性骨質(zhì)疏松小鼠干骺端附近骨小梁的數(shù)量以及減少骨小梁的平均間距,改善骨微結(jié)構(gòu),從而達(dá)到增加骨密度的作用。3、鹽酸益母草堿可以顯著提升原發(fā)性骨質(zhì)疏松小鼠血清中表達(dá)的骨鈣素水平以及堿性磷酸酶的表達(dá)。4、鹽酸益母草堿可以在小鼠體內(nèi)骨骼中增加Wnt/β-catenin通路下游蛋白β-catenin的表達(dá)以及成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá),使成骨分化活動(dòng)增加。5、鹽酸益母草堿可以在體外成骨細(xì)胞系中激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,上調(diào)LRP5、β-catenin蛋白和其mRNA的表達(dá)水平,同時(shí)提高GSK-3β的磷酸化水平以及比例。6、鹽酸益母草堿可以在體外提高成骨細(xì)胞系的MC3T3-E1的堿性磷酸酶活性及表達(dá),促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化過(guò)程。7、鹽酸益母草堿可以上調(diào)成骨細(xì)胞分化的相關(guān)基因(ALP、Runx2、osterix、Col1-α1)和成熟相關(guān)基因OPG的mRNA表達(dá)。
【圖文】：

麻醉下給予雌性8周齡C57BL/6小鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)

8圖 2，，HE 染色顯示各組小鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端附近骨小梁結(jié)構(gòu)。A 圖為假手術(shù)組，B 圖為骨質(zhì)疏松組，C 圖為骨質(zhì)疏松+鹽酸益母草堿組。淡粉色結(jié)締組織為骨小梁。（光鏡下 200X）
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R580

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本文編號(hào)：2662113