【摘要】：目的觀察Dicer基因脂肪組織特異性敲除后小鼠內(nèi)臟脂肪占體重的比例變化及內(nèi)臟脂肪棕色化程度,再誘導(dǎo)Dicer基因敲除的內(nèi)臟脂肪前體細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞分化,探索其可能的分子調(diào)控機(jī)制,從而闡述Dicer基因與小鼠內(nèi)臟白色脂肪棕色化的關(guān)系。方法1.轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建:實(shí)驗(yàn)中,我們將Dicerflox/flox小鼠與Adiponectin-Cre小鼠雜交,從而得到了Adiponectin-Cre;Dicerflox/flox脂肪組織特異性Dicer基因敲除小鼠。記錄小鼠每周體重增長(zhǎng)及食物攝入重量。2.轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)試驗(yàn):測(cè)定6周成年小鼠的體重,對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照小鼠進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)。提取小鼠內(nèi)臟脂肪組織稱重,然后4%多聚甲醛固定,石蠟包埋切片后HE染色,比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組脂肪細(xì)胞的大小。抽提內(nèi)臟白色脂肪RNA,檢測(cè)組織中UCP1(解耦聯(lián)蛋白-1)基因的表達(dá)量。3.Dicer對(duì)內(nèi)臟脂肪前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化成棕色脂肪細(xì)胞的調(diào)控作用:從Dicerflox/flox小鼠內(nèi)臟脂肪組織內(nèi)提取前體細(xì)胞,通過感染 LV-Cre-GFP病毒和LV-GFP病毒,模擬基因敲除后向棕色脂肪細(xì)胞分化的過程。通過油紅染色鑒定脂肪細(xì)胞的形成和觀察脂肪細(xì)胞的形態(tài);3.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time qPCR)技術(shù)檢測(cè)棕色脂肪細(xì)胞形成相關(guān)基因、線粒體標(biāo)志基因及產(chǎn)熱基因表達(dá)的變化;應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞解偶聯(lián)蛋白UCP1的表達(dá)差異。以此來探索Dicer基因?qū)π∈蟀咨咀厣绊懙臋C(jī)制。結(jié)果1.與對(duì)照組小鼠相比,Dicer基因脂肪組織特異性敲除小鼠內(nèi)臟脂肪含量減少(p0.005),小鼠糖代謝的能力也增強(qiáng),兩組結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.實(shí)驗(yàn)組小鼠內(nèi)臟脂肪組織中脂肪細(xì)胞體積比對(duì)照組小鼠中的體積減小(p0.01),其UCP1基因表達(dá)增加,兩組結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.005)。3.Lentivirus-Cre-GFP病毒感染組細(xì)胞經(jīng)棕色脂肪誘導(dǎo)液誘導(dǎo)成成熟的脂肪細(xì)胞后在形態(tài)上與對(duì)照組(Lentivirus-GFP感染組)無明顯差異,油紅染色均顯示有多房脂滴。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與棕色脂肪分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Prdm16、PGC-1α表達(dá)量明顯增高,產(chǎn)熱基因UCP-1和線粒體標(biāo)記基因COX8b、COX4也明顯升高,且實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞 UCP-1蛋白水平表達(dá)量高于對(duì)照組,兩組數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.005)。結(jié)論Dicer基因脂肪特異性敲除可減少小鼠內(nèi)臟脂肪含量,提高小鼠糖代謝水平。其作用機(jī)制可能是與Dicer基因調(diào)控白色脂肪前體細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞分化有關(guān)。Dicer基因敲除促進(jìn)內(nèi)臟白色脂肪前體細(xì)胞棕色化,增加能量消耗,從而減輕內(nèi)臟脂肪蓄積。
【圖文】：

攪拌，加熱，再加 57.1ml 醋酸，充分?jǐn)嚢瑁�，再加雙蒸水定容至 室溫保存。5.封閉液：1g 的 BSA+3ml 10% Triton+97ml PBS6.75%乙醇的配置：無水乙醇與雙蒸水 3 比 1 比例混合即可。7.2mg/ml I 型膠原酶的配置：100mg 膠原酶溶解于 50ml PBS 中，0.22um濾過，-20 度儲(chǔ)存?zhèn)溆�。．�?shí)驗(yàn)方法（一）轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建(1).為研究Dicer基因?qū)χ窘M織的影響，我們構(gòu)建了脂肪組織Dicer基特異敲除小鼠Adiponectin-Cre；Dicerflox/flox和對(duì)照Dicerflox/flox小鼠，前者是脂組織中Dicer被敲除的實(shí)驗(yàn)組小鼠，后者是沒有基因敲除的對(duì)照組小鼠。

結(jié) 果1．基因型鑒定結(jié)果如圖1所示，Adiponectin-Cre；Dicerflox/flox小鼠(KO) 和Dicerflox/flox小鼠(WT), DNA電泳條帶顯示如下,Cre條帶大約500bp左右,Dicer約400bp左右。圖1 實(shí)驗(yàn)小鼠模型基因鑒定
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R589.2

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本文編號(hào)：2584082