【摘要】：目的：比較類風濕關節(jié)炎關節(jié)成纖維樣滑膜細胞(RA-FLS)與正常關節(jié)成纖維樣滑膜細胞遷移、侵襲能力,并檢測RA相關miRNAs在兩種細胞中表達水平的改變,為進一步研究miRNAs在RA發(fā)病中的作用及尋找RA治療新的靶點提供實驗依據。研究對象：類風濕關節(jié)炎關節(jié)成纖維樣滑膜細胞和正常人關節(jié)成纖維樣滑膜細胞方法：選擇類風濕關節(jié)炎關節(jié)成纖維樣滑膜細胞的細胞MH7A和正常人關節(jié)成纖維樣滑膜細胞HFLS用于實驗研究。MH7A和HFLS細胞生長至匯合度80%左右時進行細胞傳代,三代至六代細胞用于實驗研究。臺盼藍染色實驗鑒定細胞活性。利用Transwell細胞遷移實驗和Transwell細胞侵襲實驗檢測并比較兩種細胞的遷移、侵襲能力。Trizol法分別提取兩組細胞的總RNA,并進行RNA定量分析。按照SYBR(?)PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit(Takara,RR716)說明書進行Poly(A)加尾反應和反轉錄成cDNA。選定用于實驗的miRNAs和內參,查找miRNAs數據庫(http://www.mirbase.org),分別找到選定miRNAs的原始序列,并按照引物設計原則進行引物設計,合成擴增miRNAs的引物。進行實時定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR),并對實驗數據進行統(tǒng)計學分析。結果：培養(yǎng)的HFLS呈長梭形、多角形,具有突起,細胞胞體較大,邊界不清晰,大小不均勻,MH7A為長梭形,排列規(guī)則。臺盼藍染色實驗顯示兩種細胞的活細胞率均大于90%,符合實驗要求。Transwell細胞遷移、侵襲實驗顯示MH7A遷移、侵襲能力較HFLS明顯增強。選定相關的11種miRNAs用于實驗,分別為miR-132、-155、-203、-223、-124、-15a、-16、18a、-19a、-26a、-146a,RT-qPCR檢測miRNAs在兩種細胞中的表達,與HFLS相比,MH7A細胞中miR-132、-155、-203、-223、-124的表達上調,其相對表達量升高,分別為2.328倍、3.882倍、6.020倍、1.343倍和1.831倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),其中miR-203表達升高最為顯著；而miR-15a、-16、18a、-19a、-26a、-146a的表達下調,其相對表達量降低,分別為0.625倍、0.367倍、0.742倍、0.602倍、0.533倍和0.424倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),其中miR-16表達降低最為顯著。結論：1.類風濕關節(jié)炎關節(jié)成纖維樣滑膜細胞遷移、侵襲能力較正常關節(jié)成纖維樣滑膜細胞明顯增強。2.RA相關的11種miRNAs在MH7A和HFLS中表達不同。RA-FLS中miRNAs的表達差異,可能直接或間接地通過調控MMPs和炎性細胞因子的分泌,調節(jié)RA-FLS的遷移和侵襲,參與RA的發(fā)病機制,這可能成為RA的診斷、監(jiān)測及治療的新靶點。
【圖文】：

成極向分布，可見細胞集落。兩種細胞均具有成纖維樣細胞的特性，細胞呈梭逡逑形，長滿時呈旋禍狀分布。與ＨＦＬＳ細胞相比，ＭＨ７Ａ細胞體積較小，樹突較少，少量呈圓逡逑形生長，胞質突起較少或較長（圖２）。逡逑圖２．Ｈ化Ｓ和ＭＨ７Ａ細胞形態(tài)W．左圈為Ｈ化Ｓ細胞（Ｘ２００）．右圖為ＭＨ７Ａ細胞（Ｘ２００）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＨＦＬＳ邋ａｎｄ邋ＭＨ７Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ，邋ＨＦＬＳ邋（Ｘ邋２００）．邋Ｔｈｅ邋ｒｉｇｈｔ，邋ＭＨ７Ａ邋（Ｘ邋２００）．逡逑４．２邐ＭＨ７Ａ和Ｈ化Ｓ細胞的活性鑒定逡逑將ＨＦＬＳ和ＭＨ７Ａ細胞分別經臺盼藍染色后，死細胞染成藍色，活細胞呈拒染。細胞活逡逑力計算：活細胞率（％）＝活細胞的總數／（活細胞的總數＋死細胞的怠數）Ｘ邋１００。顯微鏡下進逡逑行細胞計數后，結果提示ＨＦＬＳ活細胞率為９２％，ＭＨ７Ａ活細胞率為９５％，均大于９０％，符逡逑合實驗要求。逡逑４．３與ＨＦＬＳ細胞相比，ＭＨ７Ａ細胞迂移、侵襲能力顯著提高逡逑為了比較ＭＨ７Ａ與冊ＬＳ細胞遷移、侵襲能力，我們分別進行Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細胞遷移實驗逡逑和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細胞侵襲實驗，結果表明ＭＨ７Ａ細胞穿過微孔膜的遷移能力較冊ＬＳ細胞明顯增逡逑強（戶＜０．０５）（圖３Ａ、Ｃ和Ｅ），ＭＨ７Ａ細胞的穿過Ｍａｔｒｉｇｅｌ膠的侵襲能力也較冊ＬＳ細胞明顯逡逑增強（圖３Ｂ、Ｄ和Ｅ）（b6＜０．０５）。逡

成極向分布，可見細胞集落。兩種細胞均具有成纖維樣細胞的特性，細胞呈梭逡逑形，長滿時呈旋禍狀分布。與ＨＦＬＳ細胞相比，ＭＨ７Ａ細胞體積較小，樹突較少，少量呈圓逡逑形生長，胞質突起較少或較長（圖２）。逡逑圖２．Ｈ化Ｓ和ＭＨ７Ａ細胞形態(tài)W．左圈為Ｈ化Ｓ細胞（Ｘ２００）．右圖為ＭＨ７Ａ細胞（Ｘ２００）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＨＦＬＳ邋ａｎｄ邋ＭＨ７Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ，邋ＨＦＬＳ邋（Ｘ邋２００）．邋Ｔｈｅ邋ｒｉｇｈｔ，邋ＭＨ７Ａ邋（Ｘ邋２００）．逡逑４．２邐ＭＨ７Ａ和Ｈ化Ｓ細胞的活性鑒定逡逑將ＨＦＬＳ和ＭＨ７Ａ細胞分別經臺盼藍染色后，死細胞染成藍色，活細胞呈拒染。細胞活逡逑力計算：活細胞率（％）＝活細胞的總數／（活細胞的總數＋死細胞的怠數）Ｘ邋１００。顯微鏡下進逡逑行細胞計數后，結果提示ＨＦＬＳ活細胞率為９２％，ＭＨ７Ａ活細胞率為９５％，均大于９０％，符逡逑合實驗要求。逡逑４．３與ＨＦＬＳ細胞相比，ＭＨ７Ａ細胞迂移、侵襲能力顯著提高逡逑為了比較ＭＨ７Ａ與冊ＬＳ細胞遷移、侵襲能力，我們分別進行Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細胞遷移實驗逡逑和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細胞侵襲實驗，結果表明ＭＨ７Ａ細胞穿過微孔膜的遷移能力較冊ＬＳ細胞明顯增逡逑強（戶＜０．０５）（圖３Ａ、Ｃ和Ｅ），，ＭＨ７Ａ細胞的穿過Ｍａｔｒｉｇｅｌ膠的侵襲能力也較冊ＬＳ細胞明顯逡逑增強（圖３Ｂ、Ｄ和Ｅ）（b6＜０．０５）。逡
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R593.22

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本文編號：2567324