發(fā)布時間：2019-05-10 05:41

【摘要】：類風濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)滑膜炎癥和滑膜異常增生為特點,從而侵蝕鄰近的軟骨和骨組織,最終導致不可逆轉(zhuǎn)的關(guān)節(jié)損傷,為人類最常見的自身免疫性疾病之一。大量的實驗指出,異常增殖活化的成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS),可分泌多種炎癥介質(zhì),從而引起滑膜損傷,是類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件。因此,通過抑制FLS細胞的活化增殖是治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的一種方法。文獻提示,Wnt信號通路調(diào)節(jié)控制著許多細胞生物過程,其中包含細胞的生長、增殖和凋亡等。其中,經(jīng)典的Wnt信號通路在肝癌,宮頸癌,胃癌,黑色素瘤等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了極其明顯的作用。分泌型卷曲相關(guān)蛋白2(SFRP2)是一種細胞外的一種分泌性蛋白,同時它也是Wnt信號通路上游的一種拮抗劑。在多種癌細胞中發(fā)現(xiàn),SFRP2在甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)催化下,自身可發(fā)生甲基化而導致其表達顯著降低,從而激活經(jīng)典的Wnt信號通路。類風濕性關(guān)節(jié)炎中SFRP2是否發(fā)生甲基化從而激活Wnt信號通路促進FLS細胞的異常增殖,還未見文獻報道。越來越多的文獻表明中藥在類風濕性關(guān)節(jié)炎的預防和治療方面起著至關(guān)重要的作用。橙皮素(Hesperidin,HDN)是一種黃酮類化合物,主要存在于柑橘類水果中。它也是傳統(tǒng)中藥陳皮的主要成分。已知黃酮類化合物,包括HDN,具有多種生物學功能,例如抗炎、抗風濕、抗病毒和抗癌等生物活性。因此,本課題組前期合成并改進了一些橙皮素衍生物,實驗篩選發(fā)現(xiàn)橙皮素衍生物11(HDND-11)可抑制滑膜細胞增殖,通過MTT實驗檢發(fā)現(xiàn)HDND-11對FLS細胞的增殖和活化有顯著地抑制作用,并可促進SFPR2的表達。那么HDND-11對類風濕關(guān)節(jié)炎是否有治療作用,其作用機制是否與促進SFRP2的表達有關(guān),本實驗就此問題進行了研究。本課題以AA大鼠模型為對象,研究HDND-11對類風濕關(guān)節(jié)炎的治療作用及其可能的作用機制,實驗分以下6個部分。1、HDND-11對AA大鼠模型的治療作用。雄性SD大鼠通過右后足趾皮內(nèi)注射完全佐劑(CFA),建立AA大鼠模型。通過HE染色、關(guān)節(jié)炎評分、足腫脹評分以及ELISA檢測大鼠關(guān)節(jié)的炎癥程度。實驗結(jié)果表明,HDND-11對關(guān)節(jié)炎具有明顯的治療效果。2、HDND-11抑制大鼠FLS的增殖的研究。通過用MTT方法,檢測0,12.5,25,50,100,200μM六個不同濃度的HDND-11作用FLS細胞48h以及使用HDND-11(100μM)分別作用FLS細胞6h,12h,24h和48h,從而判斷HDND-11對FLS細胞的增殖的影響。此外,采取流式細胞術(shù)檢測HDND-11對FLS細胞增殖和細胞周期分布的影響。實驗結(jié)果表明,HDND-11能夠顯著地抑制FLS細胞的增殖。3、HDND-11促進AA大鼠滑膜組織和FLS細胞中SFRP2的表達的研究。通過用免疫組化、Western blot以及RT-q PCR方法檢測滑膜組織中SFRP2的表達,用Western blot、RT-q PCR以及免疫熒光檢測FLS中SFRP2的表達。實驗結(jié)果表明,與正常組相比較,AA滑膜組織和AA-FLS中SFRP2的表達顯著降低,且HDND-11能夠顯著促進模型組滑膜組織和FLS細胞中SFRP2的表達。4、SFRP2對FLS細胞增殖的研究。鑒于SFRP2在AA-FLS細胞中低表達,本文采用脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-SFRP2作用于AA-FLS細胞,用Western blot、RT-q PCR以及免疫熒光檢測FLS中SFRP2的表達。實驗結(jié)果表明,SFRP2過表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。通過MTT和流式細胞術(shù)(FCM)方法檢測過表達的SFRP2對AA-FLS增殖的影響。實驗結(jié)果表明,過表達的SFRP2能夠顯著抑制AA-FLS的增殖。5、HDND-11促進AA大鼠滑膜組織和FLS細胞中SFRP2表達機制的研究。用Western blot以及RT-q PCR方法檢測滑膜組織中DNMT1的表達,用Western blot、RT-q PCR以及免疫熒光檢測FLS中DNMT1的表達。實驗結(jié)果表明,與正常組相比較,AA滑膜組織和AA-FLS中DNMT1的表達顯著升高,且HDND-11能夠顯著抑制模型組滑膜組織和FLS細胞中DNMT1的表達。用Western blot和RT-q PCR兩種實驗方法檢測DNMT1對SFRP2蛋白及RNA表達的影響。實驗結(jié)果表明,沉默DNMT1基因的表達能夠顯著升高SFRP2基因的表達。6、HDND-11、SFRP2以及DNMT1對Wnt信號通路的影響。通過Western blot檢測HDND-11對滑膜組織及FLS細胞中β-catenin,C-myc和cyclin D1的表達的影響。實驗結(jié)果表明,HDND-11能夠顯著抑制滑膜組織及FLS細胞中β-catenin,C-myc和cyclin D1的表達,即HDND-11能夠抑制Wnt信號通路。通過Western blot檢測過表達的SFRP2和沉默的DNMT1對FLS細胞中β-catenin,C-myc和cyclin D1三種Wnt信號下游效應基因的表達的影響。最終的實驗結(jié)果表明,過表達的SFRP2和沉默的DNMT1能夠顯著抑制FLS細胞中β-catenin,C-myc和cyclin D1三種基因的表達,即高表達的SFRP2基因和低表達的DNMT1基因能夠抑制經(jīng)典的Wnt信號通路。
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【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R593.22

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Cheng Xu;Xiang-Hua Zeng;Li Wang;Shi-Qi Tao;Quan-Xin Wu;Peng Zhu;Guo-Hong Deng;Yu-Ming Wang;;sFRP-4, a potential novel serum marker for chronic hepatitis B-related hepatocellular carcinoma[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2015年02期

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本文編號：2473384