【摘要】：目的： 最近的研究證明了成骨細(xì)胞分泌的不同形式的骨鈣素在骨骼與胰島交聯(lián)作用中的地位，使得骨骼與胰腺之間相互調(diào)控和作用越來越受到關(guān)注，因此胰島素在代謝性骨病發(fā)病機(jī)制中的地位再次成為熱點(diǎn)。我們以往的研究已經(jīng)明確了代謝性骨病之一的氟骨癥主要在氟骨癥發(fā)病過程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表現(xiàn)出程度不同的活躍。成骨細(xì)胞功能活躍在氟骨癥病變中是一個(gè)起主導(dǎo)作用的環(huán)節(jié)。該課題的主要目的是考察氟骨癥這些特征性改變與胰島素對(duì)骨轉(zhuǎn)換的調(diào)控是否聯(lián)系，并闡明胰島素在氟中毒誘導(dǎo)的骨病變以及體外染氟成骨細(xì)胞的刺激作用的地位。 方法及結(jié)果： 采用灌胃給氟2月復(fù)制氟骨癥模型，并在染氟1月后經(jīng)腹腔注射一次STZ來抑制胰島素的分泌。結(jié)果顯示投氟大鼠氟斑牙特征明顯，而且隨著投氟劑量的升高，氟斑牙由半透明出現(xiàn)條紋到牙齒呈白堊色；而且STZ聯(lián)合氟處理組大鼠牙齒破環(huán)較相同投氟組明顯，尤其是高氟出現(xiàn)了牙齒缺損和斷裂。利用生化方法分析的胰島素、胰島素敏感性、血糖和HbA1C水平，結(jié)果表明了投氟明顯刺激了胰島素的分泌，相應(yīng)地血糖和HbA1C水平變化不明顯。聯(lián)合STZ處理組大鼠的胰島素在低氟組是升高的，高氟組未觀察到降低；然而STZ處理大鼠明顯影響了胰島素的降糖功能。胰島素敏感實(shí)驗(yàn)反應(yīng)了機(jī)體的胰島素效能，從血糖的變化趨勢(shì)可見投低劑量氟和聯(lián)合STZ處理引起的血糖回歸正常延時(shí)很可能歸于一定劑量的氟能降低胰島素的敏感性甚至引起胰島素抵抗發(fā)生。采用免疫組化檢測(cè)胰島內(nèi)胰島素和骨鈣素受體GPRC6A蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)投氟刺激了胰島素的分泌，而且高氟組大鼠的胰島素分泌能力提高更顯著。單獨(dú)STZ處理抑制了胰島素分泌，聯(lián)合氟處理大鼠后仍然刺激了胰島素的表達(dá)。進(jìn)一步骨密度和骨鈣素水平的分析顯示了隨著投氟量的增加，骨密度下降更明顯；STZ處理加重了骨密度的下降，且投氟越高骨密度下降越明顯。單獨(dú)氟處理大鼠輕度誘導(dǎo)了GPRC6A的蛋白表達(dá)，而聯(lián)合STZ處理后投氟反而引起了該受體的表達(dá)下降。骨鈣素僅在給予高氟條件下輕度升高，聯(lián)合應(yīng)用STZ處理組后各投氟組間骨鈣素變化不顯著。鑒于OCN與GPRC6A之間的關(guān)系，可見氟能夠輕度刺激GPRC6A表達(dá)和提高血液中的骨鈣素含量。聯(lián)系前面觀察到的氟明顯刺激胰島素的分泌；同時(shí)，STZ及聯(lián)合氟作用降低了胰島素的敏感性，影響GPRC6A在胰島內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致其下降。利用定量PCR技術(shù)分析了投氟或聯(lián)合STZ處理組大鼠成骨、破骨標(biāo)志及相關(guān)調(diào)控基因的變化。結(jié)果顯示出低量氟明顯誘導(dǎo)成骨細(xì)胞早期分化，高劑量氟對(duì)誘導(dǎo)分化作用不明顯。STZ聯(lián)合投氟處理明顯抑制了成骨早期分化，但對(duì)成骨晚期分化有一定作用。投氟顯著刺激了破骨細(xì)胞的功能，STZ降低了破骨細(xì)胞的功能，而且聯(lián)合投氟破骨作用不明顯。破骨調(diào)控因子的變化顯示了投氟顯著刺激了破骨和骨吸收。STZ處理并沒有明顯抑制破骨相關(guān)基因的表達(dá)，但是聯(lián)合投氟顯著促進(jìn)OPG表達(dá)和降低RANKL基因，說明了兩者聯(lián)合應(yīng)用抑制了破骨活性。TGFβ、β-catenin和Wnt10的基因變化說明了TGFβ在氟誘導(dǎo)成骨和破骨過程中起到重要作用，而且在STZ誘導(dǎo)的胰島素敏感性下降而導(dǎo)致氟誘導(dǎo)成骨晚期分化和破骨過程中起到一定作用。而β-catenin和Wnt10主要參與了氟作用下引起成骨、破骨活性改變，，STZ聯(lián)合氟處理一定程度抑制了大鼠骨組織β-catenin的表達(dá)，主要體現(xiàn)了成骨受抑制而引起其表達(dá)。 利用出生三周的Wistar小鼠股骨和脛骨收集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)觀察。選取穩(wěn)定和細(xì)胞種類純化的第三代的BMSC，礦化液孵育28天后茜素紅S染色，觀察到細(xì)胞出現(xiàn)融合和多層細(xì)胞疊加呈紫色或粉色的團(tuán)塊,說明了本實(shí)驗(yàn)收集的BMSC傳至第三代后主要是由成骨潛能的干細(xì)胞組成,從而為下面的成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。染氟或胰島素處理細(xì)胞能夠刺激BMSC活性，而且胰島素聯(lián)合在低、中劑量氟作用下加強(qiáng)了細(xì)胞活性，但是胰島素聯(lián)合高劑量氟加重抑制了細(xì)胞活性，體現(xiàn)了胰島素對(duì)成骨增生作用與氟刺激成骨作用一致。通過改良鈣-鈷法進(jìn)行堿性磷酸酶染色，觀察分化細(xì)胞早期情況。低、中劑量染氟明顯刺激了BMSC細(xì)胞早期分化，但是高量氟顯著抑制了該細(xì)胞的分化；聯(lián)合胰島素處理BMSC細(xì)胞也是呈現(xiàn)低、中劑量氟的刺激作用和高劑量氟對(duì)細(xì)胞早期成骨分化的抑制作用，這種協(xié)同作用主要體現(xiàn)在高劑量氟對(duì)ALP的抑制作用。 利用MC3T3-E1細(xì)胞作為體外成骨細(xì)胞前體染氟模型。通過不同劑量氟和胰島素對(duì)該細(xì)胞增殖活性的影響，確定了能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞活性的染氟濃度1、2、8mgF-/L和50nmmol/L為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件。為了觀察胰島素受體對(duì)染氟成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)成骨和破骨活性的影響，我們采用基因干擾（siRNA）有效降低了胰島素受體在成骨細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。采用CCK-8方法觀察了從低到高劑量氟聯(lián)合胰島素作用對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示出染氟對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響主要集中在低和中劑量氟處理組，胰島素不僅本身刺激成骨細(xì)胞活性，而且能夠加強(qiáng)氟刺激成骨細(xì)胞活性的作用。定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析了成骨細(xì)胞內(nèi)胰島素受體底物及與骨鈣素調(diào)控胰島素分泌密切相關(guān)因子Esp和FoxO1，結(jié)果顯示出胰島素受體有效抑制后，明顯降低了胰島素受體底物，但顯著激發(fā)了Esp基因的表達(dá)；聯(lián)合染氟后不同程度地誘導(dǎo)了胰島素受體的基因表達(dá)和激活胰島素受體底物的表達(dá)，相應(yīng)地降低了Esp基因。說明了氟能夠顯著刺激胰島素受體的表達(dá)并通過胰島素受體底物和Esp基因信號(hào)通路相互協(xié)調(diào)發(fā)揮其調(diào)控成骨細(xì)胞的作用。進(jìn)一步定量分析了染氟成骨細(xì)胞內(nèi)成骨和破骨調(diào)控因子在胰島素受體表達(dá)受抑制后的表達(dá)變化。胰島素受體主要影響成骨轉(zhuǎn)錄因子osterix和骨鈣素發(fā)揮刺激成骨作用，而MAPK信號(hào)通路參與胰島素調(diào)控的成骨活性過程。另一方面，破骨細(xì)胞分化調(diào)控因子的變化說明了胰島素受體主要通過調(diào)控OPG基因的表達(dá)變化發(fā)揮調(diào)控破骨細(xì)胞分化作用。 結(jié)論: 通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)氟斑牙病變程度隨著投氟量的增加而加重，鏈尿佐菌素抑制胰島素分泌加重氟中毒癥狀。氟能夠輕度刺激GPRC6A表達(dá)和提高血液中的骨鈣素含量，明顯刺激胰腺分泌胰島素作用。不同濃度氟作用大鼠可引起胰島素敏感性的變化。鏈尿佐菌素（STZ）抑制大鼠胰島素降糖效應(yīng)，同時(shí)也導(dǎo)致胰島素敏感性下降引起胰島素抵抗,造成機(jī)體各器官對(duì)胰島素調(diào)控作用不敏感。投氟誘導(dǎo)大鼠骨密度下降，且投氟越高骨密度下降。聯(lián)合成骨和破骨標(biāo)志物和基因的變化，說明了給氟激發(fā)了大鼠股骨活躍的骨轉(zhuǎn)換。大鼠胰島素活性和敏感性下降明顯影響了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化和進(jìn)一步加重骨病變。TGFβ在氟誘導(dǎo)成骨和破骨過程中起到重要作用，而且參與了胰島素對(duì)氟誘導(dǎo)的骨轉(zhuǎn)換發(fā)生調(diào)控機(jī)制。氟通過調(diào)控β-catenin和Wnt10途徑發(fā)揮調(diào)控成骨、破骨活性作用。體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了一定劑量氟刺激骨髓間充質(zhì)細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞的增生和誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化；胰島素刺激兩種細(xì)胞細(xì)胞增生，但誘導(dǎo)成骨細(xì)胞早期分化作用不明顯。胰島素主要通過胰島素受體介導(dǎo)胰島素受體底物和Esp基因參與氟誘導(dǎo)的成骨和破骨活性變化。胰島素主要影響了成骨分化后期osterix和骨鈣素的表達(dá)來參與氟誘導(dǎo)的成骨作用；同樣地，它也是主要通過對(duì)OPG的表達(dá)來參與氟誘導(dǎo)的破骨作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R599.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 聶宇;;轉(zhuǎn)化生長因子β與骨質(zhì)疏松癥關(guān)系的研究進(jìn)展[J];安徽醫(yī)藥;2010年12期

2 趙軼卓;齊玲;徐輝;井玲;;氟對(duì)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞TGF-β和Smad2/3表達(dá)的影響[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年06期

3 范中學(xué),李平安,劉曉莉,李曉茜;骨苓通痹丸治療1500例氟骨癥療效觀察[J];地方病通報(bào);2005年03期

4 董寶平;氟中毒及其治理[J];化學(xué)教育;2005年10期

5 張莉莉;李玉坤;;生長因子對(duì)骨代謝影響的研究進(jìn)展[J];國際藥學(xué)研究雜志;2012年02期

6 史立群;陳曉亮;李希寧;徐輝;李廣生;;投氟對(duì)大鼠胰島素水平的影響[J];中國地方病防治雜志;2013年05期

7 李鳳;劉佰純;呂鵬;齊曉晨;李希寧;;氟對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠的毒性作用及其對(duì)糖尿病進(jìn)程的影響[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年01期

8 趙長青;顧宏圖;邢楓;周揚(yáng);徐列明;;乙型肝炎肝硬化合并糖尿病的臨床特點(diǎn)[J];臨床肝膽病雜志;2012年06期

9 馮夢(mèng)蝶;覃敏珍;梁柯;藍(lán)常明;;阿托伐他汀治療Ⅱ型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的療效觀察[J];臨床肝膽病雜志;2013年07期

10 余達(dá)林,崔舜;氟化鈉對(duì)成骨細(xì)胞增殖及分化影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2000年05期

本文編號(hào)：2458952