【摘要】：目的:生活水平提高、久坐不動的生活模式及社會老齡化等多種因素,導(dǎo)致糖尿病發(fā)病率的迅猛增加。2型糖尿病是多種因素共同作用的結(jié)果,其中胰島素抵抗是2型糖尿病的病理基礎(chǔ)之一。胰島素抵抗是指正常劑量的胰島素生物學(xué)效應(yīng)低于正常的一種狀態(tài),發(fā)生在肝細胞、肌細胞、脂肪細胞等組織細胞中。以下三種情況均可引起胰島素抵抗,分別是胰島素受體前缺陷、胰島素受體缺陷和胰島素受體后缺陷,其中受體后缺陷與胰島素信號通路在細胞內(nèi)傳遞異常有關(guān),包括IRS家族異常、PI3-激酶(PI3K)信號通路異常、葡萄糖載體蛋白(Glut)異常、細胞內(nèi)葡萄糖磷酸化障礙等。正常情況下,胰島素與靶細胞膜特異受體相結(jié)合,通過激活細胞內(nèi)一系列信號級聯(lián)反應(yīng)通路,胰島素信號被轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞內(nèi)部。但當胰島素信號傳導(dǎo)通路異常出現(xiàn)胰島素抵抗時,胰島素對細胞的生物效應(yīng)下降,葡萄糖分解利用率降低機體糖平衡紊亂。因此進一步深入探究靶細胞胰島素抵抗的具體分子機制,對于明確糖尿病的發(fā)病原因和治療方法有重要意義。蛋白激酶Cζ(PKCζ)屬于非典型PKC家族成員,位于PI3K信號通路下游,在多種細胞外刺激因素作用下參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控多種細胞生理功能。在胰島素刺激下PKCζ通過調(diào)控AMPK等因子影響下游通路蛋白,是調(diào)控細胞糖攝取,影響細胞糖平衡的重要因子之一,但是目前對PKCζ激活的具體分子機制善不清楚。因此,了解PKCζ在胰島信號通路中的激活機制及其影響因素對更好的闡述PKCζ的功能有重要意義。方法:1、siRNA轉(zhuǎn)染后選取一個成功降表達序列,構(gòu)建SIN1降表達Hep G2細胞株,葡萄糖氧化酶法檢測SIN1下調(diào)后對細胞葡萄糖攝取率的影響;2、免疫共沉淀和免疫熒光共聚焦技術(shù)探究胰島素刺激下Hep G2細胞SIN1與PKCζ是否存在結(jié)合關(guān)系,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染刪除SIN1的Pleckstrin Homology domain(PH結(jié)構(gòu)域),免疫共沉淀檢測結(jié)合關(guān)系是否依然存在;3、Western blotting方法檢測SIN1缺乏對PKCζ磷酸化及PKCζ轉(zhuǎn)位的影響,以明確SIN1與PKCζ的活化是否有關(guān),進而影響細胞糖攝取;4、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達SIN1,觀察SIN1上調(diào)對PKCζ磷酸化及轉(zhuǎn)位的影響;5、免疫共沉淀和免疫熒光共聚焦技術(shù)探究胰島素刺激下Hep G2細胞β-Tubulin與PKCζ是否存在結(jié)合關(guān)系;100 nmol/L胰島素分別干預(yù)0 min、1 min、5 min、10 min、20 min、30 min,利用免疫共沉淀方法分別探討SIN1、β-Tubulin與PKCζ結(jié)合關(guān)系隨著刺激時間延長而變化的關(guān)系;6、紫杉醇(PTX)或諾考達唑(NDZ)分別處理4 h破壞細胞微管的解聚或聚合,100 nmol/L胰島素刺激10 min,胞質(zhì)胞膜分離,研究細胞微管破壞對PKCζ轉(zhuǎn)位的影響,Western blotting檢測微管破壞對PKCζ以及PKCζ下游信號分子絲切蛋白Cofilin磷酸化影響。結(jié)果:SIN1降表達后,HepG2細胞24 h攝糖量在無胰島素刺激和胰島素刺激下均下降,無胰島刺激素時,細胞攝糖率由35.27%±2.77%下降至30.83%±2.34%(p0.05),胰島素刺激時,由39.95%±3.20%降至32.26%±3.61%(p0.05),數(shù)據(jù)進一步分析顯示,SIN1降表達細胞株對胰島素刺激敏感度下降;免疫共沉淀和共聚焦結(jié)果均提示,SIN1與PKCζ存在結(jié)合關(guān)系,胰島素刺激后結(jié)合依然存在并保持不變,SIN1 PH結(jié)構(gòu)域刪除后,結(jié)合減弱;胰島素刺激下SIN1降表達細胞PKCζ磷酸化減弱,PKCζ轉(zhuǎn)位受到抑制,與之相反,SIN1過表達增強PKCζ的磷酸化和轉(zhuǎn)位。免疫共沉淀和共聚焦結(jié)果同時提示,β-Tubulin與PKCζ存在結(jié)合關(guān)系,胰島素刺激后結(jié)合先減弱后增強,PTX與NDZ處理后,PKCζ轉(zhuǎn)位受到抑制,PKCζ下游的Coffin磷酸化減弱。結(jié)論:本研究結(jié)果顯示,靜息狀態(tài),SIN1通過PH功能域與PKCζ形成穩(wěn)定的結(jié)合關(guān)系,且胰島素刺激下,這種結(jié)合仍然存在,并共同定位于細胞膜邊緣。SIN1降表達后Hep G2細胞攝糖率減少,PKCζ磷酸化及轉(zhuǎn)位也受到抑制,表明SIN1可能通過與細胞中PKCζ結(jié)合調(diào)控PKCζ的磷酸化及轉(zhuǎn)位進而影響細胞糖平衡,同時β-Tubulin也參與PKCζ轉(zhuǎn)位的調(diào)控,微管的聚散影響PKCζ活性及下游分子活性。在胰島素刺激下,PKCζ借助微管平臺被PI3K激活影響細胞糖代謝。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.1

【參考文獻】

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本文編號：2452354