【摘要】：目的microRNA是一類進(jìn)化上高度保守,長度約為22nt的單鏈小分子非編碼RNA,參與轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控。脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化存在著相互制約的關(guān)系。有研究表明microRNA在間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化過程中起到重要的調(diào)控作用。本研究以miR-20a-5p為對(duì)象探討其對(duì)于脂肪細(xì)胞分化的作用及作用機(jī)制,并探討在體內(nèi)抑制miR-20a-5p的表達(dá)后對(duì)于小鼠肥胖的影響。方法1.分離并培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-20a-5p在誘導(dǎo)成脂分化過程中的差異表達(dá),并檢測了miR-20a-5p在骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2誘導(dǎo)成脂分化過程中的表達(dá)變化;分析ob/ob肥胖小鼠及正常C57BL/6J小鼠脂肪細(xì)胞中miR-20a-5p的表達(dá)差異。在骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2及間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2中提高或降低miR-20a-5p的水平,利用q RT-PCR、western blotting和Oil Red O Staining等技術(shù)觀察miR-20a-5p對(duì)ST2和C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化的影響。2.利用靶基因預(yù)測軟件及熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)鑒定miR-20a-5p的靶基因,并通過基因功能缺失性和獲得性研究探索靶基因調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的作用機(jī)制。3.采用高脂飲食喂養(yǎng)小鼠8周誘導(dǎo)肥胖模型,同時(shí)尾靜脈注射構(gòu)建好的miR-20a-5p sponge慢病毒,在飼養(yǎng)過程中記錄小鼠體重。飼養(yǎng)結(jié)束后,稱取各組小鼠體重和脂肪重量,取血清檢測血糖、血脂等相關(guān)生化指標(biāo),采用蘇木精-伊紅(HE)染色方法對(duì)各組小鼠的脂肪組織進(jìn)行石蠟切片染色,q RT-PCR檢測各組小鼠脂肪組織脂肪分化及合成關(guān)鍵因子的表達(dá)量。結(jié)果1.miR-20a-5p在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及ST2細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化的過程中表達(dá)上升,并且在ob/ob肥胖小鼠脂肪組織中的表達(dá)水平顯著高于正常C57BL/6小鼠。在ST2細(xì)胞、C3H10T1/2細(xì)胞和小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中增強(qiáng)miR-20a-5p表達(dá)后,細(xì)胞成脂分化加強(qiáng),脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCATT增強(qiáng)結(jié)合蛋白α(CCATT enhancer binding protein alpha,C/EBPα)、CCATT增強(qiáng)結(jié)合蛋白β(CCATT enhancer binding protein beta,C/EBPβ)和表征因子脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty acid-binding protein,a P2)等表達(dá)顯著升高。相反,抑制內(nèi)源性miR-20a-5p表達(dá)則可抑制ST2等細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞。2.通過生物信息學(xué)在線分析工具預(yù)測了miR-20a-5p的候選靶基因?yàn)門GF-βII型受體(transforming growth factor-βreceptor II,Tgfbr2)、賴氨酸特異性脫甲基酶酶6B(lysine-specific demethylase 6B,Kdm6b)、Wwtr1(WW domain containing transcription regulator 1)、骨硬化相關(guān)跨膜蛋白(osteopetrosis associated transmembrane protein 1,Ostm1)和核轉(zhuǎn)錄因子-C(nuclear factor I-C,Nfic),成功構(gòu)建了包含miR-20a-5p應(yīng)答序列的Tgfbr2、Kdm6b、Wwtr1、Ostm1和Nfic3’UTR的重組報(bào)告載體,熒光素酶報(bào)告基因測定證實(shí)了miR-20a-5p能夠結(jié)合Tgfbr2、Kdm6b和Nfic 3’UTR而阻斷其表達(dá)。靶基因功能研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)Kdm6b能夠抑制ST2細(xì)胞成脂分化,抑制Kdm6b則會(huì)顯著促進(jìn)ST2細(xì)胞成脂分化。NFIC能夠通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控Lrp5表達(dá)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,從而抑制成脂分化而促進(jìn)成骨分化。此外,研究證實(shí)NFIC能夠與miR-20a-5p promoter結(jié)合,抑制miR-20a-5p的表達(dá),提示miR-20a-5p與NFIC之間存在調(diào)節(jié)環(huán)路,協(xié)同調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化。3.高脂飲食誘導(dǎo)8周后成功構(gòu)建肥胖小鼠模型,具體表現(xiàn)為高脂飲食組體重增加、Lee’s指數(shù)變大、脂肪重量增加、脂肪細(xì)胞體積變大、糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗。而尾靜脈注射miR-20a-5p sponge慢病毒后能夠有效抑制高脂飲食鼠肥胖的發(fā)生,同時(shí)降低血糖、甘油三酯、游離脂肪酸等糖脂代謝生化指標(biāo),提高機(jī)體對(duì)于胰島素的敏感性。q RT-PCR檢測尾靜脈注射miR-20a-5p sponge慢病毒后能有效抑制脂肪分化及合成關(guān)鍵因子的表達(dá)。結(jié)論1.miR-20a-5p與肥胖密切相關(guān),表現(xiàn)為在肥胖小鼠脂肪組織及分化成熟的脂肪細(xì)胞中高表達(dá)。miR-20a-5p可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、ST2和C3H10T1/2的成脂分化。2.Tgfbr2、Kdm6b和Nfic為miR-20a-5p的靶基因,且均為脂肪細(xì)胞分化的負(fù)性調(diào)控因子,miR-20a-5p能夠靶向抑制Tgfbr2、Kdm6b和Nfic的表達(dá)。3.Kdm6b能夠抑制ST2細(xì)胞成脂分化。NFIC能夠通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)控Lrp5表達(dá)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,從而抑制成脂分化而促進(jìn)成骨分化。4.NFIC能夠與miR-20a-5p啟動(dòng)子結(jié)合,抑制miR-20a-5p的轉(zhuǎn)錄,miR-20a-5p與NFIC形成了負(fù)調(diào)控環(huán)路,共同調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的定向分化。5.在小鼠體內(nèi),抑制miR-20a-5p的表達(dá)能夠抑制肥胖發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R589.2

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本文編號(hào)：2424792