【摘要】：目的:1.探索低濃度PCB118對大鼠甲狀腺FRTL-5細胞活力和細胞凋亡的影響;2.探索低濃度PCB118對大鼠甲狀腺FRTL-5細胞重要功能基因NIS mRNA,蛋白表達量及NIS啟動子活性的影響;3.探索低濃度PCB118引起大鼠甲狀腺FRTL-5細胞重要功能基因NIS基因及蛋白水平發(fā)生變化的可能的分子生物學機制。方法:1.將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的大鼠FRTL-5細胞消化計數(shù)后,鋪于96孔板中,用空白對照(培養(yǎng)基),溶劑對照(DMSO)及不同濃度的PCB118(0,0.025,0.25,2.5,25,250,2500,25000nM/L)分別刺激24h,48h及72h后,行CCK-8實驗,用分光光度計在450nm波長處測吸光度值,計算細胞活力。2.根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果,選擇不影響細胞活力的低濃度PCB118(0,0.025,0.252.5,25nM/L)刺激FRTL-5細胞72h后,收集細胞上清,應用流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率。3.不同低濃度PCB118(0,0.025,0.25,2.5,25nM/L)刺激FRTL-5細胞24h或48h后,RT-PCR方法檢測細胞Akt,FoxO3a,NIS mRNA的表達水平,Western blotting方法檢測細胞Akt,p-Akt,FoxO3a,p-FoxO3a及NIS蛋白表達水平。4.不同低濃度PCB118(0,0.025,0.25,2.5,25nM/L)刺激FRTL-5細胞48h后,熒光素酶報告基因的方法檢測大鼠甲狀腺FRTL-5細胞NIS及FoxO3a基因啟動子活性。5.分別將持續(xù)激活型Akt(CA-Akt)質(zhì)粒、負顯性失活型Akt(DN-Akt)質(zhì)粒及空白對照(BC)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠甲狀腺FRTL-5細胞,用0,25nM/L的PCB118刺激細胞48h后,提取蛋白后用Western blotting方法檢測細胞p-Akt,p-FoxO3a及NIS蛋白表達水平。6.分別將FoxO3a-siRNA及其陰性對照(NC)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠甲狀腺FRTL-5細胞,用0,25nM/L的PCB118刺激細胞48h后,提取蛋白后用Western blotting方法檢測細胞FoxO3a,p-FoxO3a及NIS蛋白表達水平。7.分別將pc DNA3-FoxO3a或其對照質(zhì)粒pc DNA3與NIS基因啟動子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染大鼠甲狀腺FRTL-5細胞,用0,25nM/L的PCB118刺激細胞48h后,熒光素酶報告基因方法檢測FoxO3a過表達后NIS基因啟動子活性的變化。結(jié)果:1.PCB118刺激FRTL-5細胞24h,48h,72h,空白對照組FRTL-5細胞活力與溶劑對照組(DMSO)比較未見明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),相對低濃度PCB118處理組(0.025,0.25,2.5,25 nM/L)與溶劑對照組比較亦未見明顯差異(P0.05),各處理組間比較也未見明顯統(tǒng)計學差異(P0.05);而相對高濃度PCB118處理組(250,2500,25000 nM/L)與溶劑對照組比較,在刺激時間為48h和72h,細胞生存率可見明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),在刺激時間為24h時,相對高濃度PCB118處理組(250,2500,25000 nM/L)的細胞生存率與溶劑對照組比較未見明顯差異(P0.05)。2.與溶劑對照組比較,各PCB118處理組(0.025,0.25,2.5,25nM/L)細胞凋亡率未見明顯差異(P0.05),各PCB118處理組間亦未見明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。3.(1)不同低濃度PCB118(0.025,0.25,2.5,25nM/L)刺激FRTL-5細胞24h后,與溶劑對照組比較,各PCB118處理組Akt mRNA的表達水平均明顯增加(P0.05),FoxO3a的mRNA表達水平未見明顯變化(P0.05),而各PCB118處理組NIS mRNA表達水平均明顯降低(P0.05);(2)不同低濃度PCB118(0.025,0.25,2.5,25nM/L)刺激FRTL-5細胞24h后,各PCB118處理組Akt,p-Akt,p-FoxO3a蛋白表達水平與溶劑對照組比較均明顯增加(P0.05),FoxO3a蛋白表達水平未見明顯變化(P0.05),而各PCB118處理組的NIS蛋白表達水平與溶劑對照組比較均明顯降低(P0.05)。4.不同低濃度PCB118(0.025,0.25,2.5,25nM/L)刺激細胞48h后,NIS基因啟動子活性與溶劑對照組比較可見明顯降低(P0.05),而FoxO3a基因啟動子活性與溶劑對照組比較可見明顯增加(P0.05),各處理組間比較未見明顯差異(P0.05)。5.CA-Akt質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,分別與溶劑對照及PCB118處理組的空白對照比較,濃度為25nM/L PCB118處理組p-Akt,p-FoxO3a蛋白表達量均顯著增加(P0.05),NIS蛋白表達量均明顯降低(P0.05);而在轉(zhuǎn)染DN-Akt質(zhì)粒后上述結(jié)果相反(P0.05)。6.用FoxO3a-siRNA轉(zhuǎn)染細胞后,在溶劑對照組及25nM/L PCB118處理組,均可見FoxO3a及p-FoxO3a蛋白表達量有明顯下調(diào)(P0.05);分別同溶劑對照及PCB118處理組陰性對照(NC)比較,FoxO3a-siRNA誘導FoxO3a表達水平的下調(diào)可導致25nM/L PCB118處理組NIS蛋白表達水平顯著增加(P0.05)。7.將pc DNA3-FoxO3a或其對照質(zhì)粒pc DNA3與NIS基因啟動子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染大鼠甲狀腺FRTL-5細胞后,分別同溶劑對照及PCB118處理組空白對照(BC)比較,25nM/L PCB118處理組NIS基因啟動子活性均明顯增加(P0.05)。結(jié)論:1.低濃度PCB118(0.025,0.25,2.5,25nM/L)處理細胞24h或48h后,對細胞活力及凋亡率均無影響;2.低濃度PCB118可通過Akt/FoxO3a/NIS信號轉(zhuǎn)導通路引起甲狀腺功能障礙。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R581

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本文編號：2353403