【摘要】：【目的】中國(guó)目前有超過(guò)1億人口患糖尿病,糖尿病腎病(Diabetic nephropahty,DN)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一,也是引起終末期腎病的首要原因。微量蛋白尿是早期發(fā)現(xiàn)DN和指導(dǎo)臨床治療DN的重要指標(biāo)。有效的藥物治療并減少蛋白尿的產(chǎn)生對(duì)改善DN的進(jìn)程尤為重要。紅景天苷(Salidroside,SAL)是天然植物紅景天(Rhodiola Rosea)的主要成分。最近報(bào)道紅景天苷可以抑制高糖所致的系膜細(xì)胞增生,紅景天的醇提取物對(duì)DN有保護(hù)作用,然而紅景天苷是否對(duì)DN有保護(hù)作用還不清楚。本課題主要是探究紅景天苷能否緩解糖尿病相關(guān)蛋白尿并探討其中的機(jī)制。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(Glomerular endothelial cell,GECs)是腎小球?yàn)V過(guò)膜的第一道屏障,在蛋白尿發(fā)生中有重要作用。由于GECs也是內(nèi)皮細(xì)胞,同時(shí)考慮到小窩蛋白(Caveolin-1,Cav-1)在白蛋白跨血管內(nèi)皮的穿胞中有重要作用,而且在Cav-1-/-鼠沒(méi)有觀察到蛋白尿,人和鼠的腎臟內(nèi)皮均有Cav-1的表達(dá),我們猜想白蛋白是否也是通過(guò)跨GECs穿胞從而產(chǎn)生蛋白尿。為了便于研究蛋白尿產(chǎn)生的機(jī)制,我們首先建立了白蛋白體外穿胞模型。同時(shí),我們采用國(guó)際公認(rèn)的糖尿病腎病模型鼠(db/db鼠)探索紅景天苷能否緩解其腎臟病變和蛋白尿,利用建立的白蛋白體外穿胞模型研究其機(jī)制,并進(jìn)一步探究其上游的信號(hào)通路�！痉椒ā�1.建立白蛋白體外穿胞模型用異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)代替放射性物質(zhì)標(biāo)記白蛋白,便于示蹤觀察白蛋白穿胞。利用穿胞是由受體介導(dǎo)的并高度受調(diào)控的原理,建立白蛋白體外穿胞模型。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用國(guó)際公認(rèn)的糖尿腎病模型db/db鼠(雄性,9周齡),用二甲雙胍(200 mg/kg/day)、紅景天苷(25,50,100mg/kg/day)、甲基-β-環(huán)糊精(mβcd,100mg/kg/week)、n-乙基馬來(lái)酰亞胺(nem,1.7mg/kg/week)或者生理鹽水處理小鼠11周(n=12~15)。同時(shí),雄性9周齡db/m鼠為非糖尿病腎病組(wt組)進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn),給予等量的生理鹽水處理11周。藥物處理11周后,尾靜脈采血檢測(cè)餐后2h血糖;用代謝籠收集小鼠24h尿液儲(chǔ)存?zhèn)溆?小鼠麻醉后,收集血液和腎臟標(biāo)本。用試劑盒檢測(cè)血肌酐、尿肌酐;用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)試劑盒檢測(cè)尿微量白蛋白,并計(jì)算尿白蛋白/尿肌酐比值;新鮮腎臟組織用4%多聚甲醛固定后包埋、切片,行過(guò)碘酸雪夫染色(periodicacid-shiffstain,pas),檢測(cè)腎臟腎小球及系膜的形態(tài)學(xué)改變。3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)利用建立的白蛋白體外穿胞模型,進(jìn)一步探討紅景天苷在低糖和高糖情況下對(duì)白蛋白跨gecs穿胞的影響,同時(shí)檢測(cè)穿胞的相關(guān)分子對(duì)白蛋白跨gecs穿胞的影響;用westernblot方法在gecs中檢測(cè)腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase,ampk)、src和cav-1等蛋白的磷酸化情況來(lái)研究白蛋白穿胞的相關(guān)調(diào)節(jié)通路,以及在紅景天苷抑制白蛋白跨gecs穿胞中的調(diào)控作用;用ampksirna和cav-1sirna轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別下調(diào)ampk和cav-1蛋白的表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)其在穿胞中的作用以及與紅景天苷抑制白蛋白穿胞的關(guān)系;用mitosoxtmred探針和jc-1探針?lè)謩e檢測(cè)線粒體活性氧(mitochondrialreactiveoxygenspecies,mtros)和線粒體膜電位的變化,進(jìn)一步探討線粒體超氧化物的產(chǎn)生和線粒體膜電位與白蛋白穿胞的關(guān)系以及在紅景天苷抑制白蛋白穿胞中的作用;細(xì)胞攝取白蛋白實(shí)驗(yàn)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察白蛋白穿胞的中間狀態(tài),進(jìn)一步證實(shí)紅景天苷與穿胞的相關(guān)分子的作用。【結(jié)果】1.建立白蛋白體外穿胞模型(1)用fitc代替放射性物質(zhì)成功標(biāo)記白蛋白,并具有穩(wěn)定性和可操作性。(2)成功建立白蛋白體外穿胞模型。模型成功的關(guān)鍵必須考慮器材孔徑的選擇、熒光示蹤劑的選擇、區(qū)分穿胞的白蛋白與細(xì)胞間隙漏出的白蛋白、白蛋白影響滲透壓、白蛋白的代謝等因素。(3)我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)fitc-albumin穿胞的量具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性。該模型的建立為臨床上蛋白尿的發(fā)生提供了直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù);可用于研究其他大分子物質(zhì)的穿胞;還可用于體外藥物篩選,篩選降低白蛋白尿的藥物。2.紅景天苷能明顯緩解db/db小鼠糖尿病腎病(1)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,與db/m對(duì)照組相比,db/db鼠血糖、左腎重、血肌酐、尿白蛋白/尿肌酐等指標(biāo)明顯增加(p0.05orp0.01),腎小球體積和腎小球系膜增加,符合糖尿病腎病模型特征。(2)紅景天苷處理動(dòng)物后能顯著降低血糖、左腎重、血肌酐、尿白蛋白/尿肌酐等指標(biāo)(p0.05orp0.01)。意外的是,二甲雙胍雖然可以降低db/db鼠血糖水平,但是不能減少db/db鼠尿白蛋白/尿肌酐的比值。穿胞抑制劑mβcd和nem對(duì)血糖和血肌酐沒(méi)有明顯影響,僅降低db/db鼠尿白蛋白/尿肌酐的比值。(3)與腎臟功能指標(biāo)相一致的是,腎臟pas染色結(jié)果顯示紅景天苷可以減少db/db鼠腎小球表面積和腎小球系膜面積,緩解腎臟形態(tài)學(xué)改變,而二甲雙胍、mβcd和nem對(duì)db/db鼠腎臟的形態(tài)學(xué)改變沒(méi)有明顯的影響。3.紅景天苷可通過(guò)減少白蛋白跨gecs穿胞來(lái)抑制蛋白尿的產(chǎn)生及其機(jī)制研究(1)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,利用建立的白蛋白體外穿胞模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅景天苷能劑量依賴性的明顯減少低糖和高糖情況下白蛋白跨gecs穿胞,然而二甲雙胍增加低糖情況下白蛋白的穿胞,對(duì)高糖時(shí)白蛋白穿胞的影響不明顯。mβcd和nem能減少低糖和高糖情況下白蛋白跨gecs穿胞。(2)在穿胞模型中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ampk的激動(dòng)劑aicar、src的抑制劑pp2均抑制高糖情況下白蛋白的穿胞,同時(shí)ampk的抑制劑compoundc可以部分恢復(fù)紅景天苷抑制白蛋白在高糖時(shí)的穿胞。(3)westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)紅景天苷可以劑量依賴性的促進(jìn)ampk磷酸化,同時(shí)還能抑制src和cav-1的磷酸化;用cav-1sirna轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)cav-1表達(dá)減少的同時(shí)也抑制了白蛋白的穿胞。(4)src/cav-1途徑和ampk/cav-1途徑均參與紅景天苷抑制白蛋白穿胞:westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高糖刺激可以抑制ampk磷酸化并且激活src激酶和cav-1,這兩者都能增加Cav-1介導(dǎo)的白蛋白穿胞;紅景天苷可以劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)高糖引起的AMPK、Src以及Cav-1活性的改變;用AMPK siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMPK表達(dá)減少的同時(shí)Cav-1磷酸化增加,而且還促進(jìn)了白蛋白的穿胞;AMPK siRNA還能部分抑制紅景天苷阻斷高糖上調(diào)Cav-1磷酸化的效應(yīng),但是對(duì)紅景天苷阻斷Src的磷酸化沒(méi)有影響。(5)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能激活低糖和高糖時(shí)的AMPK,但是與紅景天苷不一樣的是,二甲雙胍促進(jìn)了低糖時(shí)Src和Cav-1的磷酸化,對(duì)高糖時(shí)Src激酶和Cav-1的磷酸化水平?jīng)]有明顯影響。(6)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以抑制高糖時(shí)Src和Cav-1的活性。MitoSOXTM Red探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高糖促進(jìn)mtROS產(chǎn)生,NAC減少高糖時(shí)mtROS的產(chǎn)生,紅景天苷可以減少低糖和高糖時(shí)mtROS的產(chǎn)生;不同的是二甲雙胍增加低糖時(shí)mtROS的產(chǎn)生,對(duì)高糖時(shí)mtROS沒(méi)有明顯影響。JC-1探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高糖使線粒體膜電位超級(jí)化,紅景天苷、二甲雙胍、NAC、線粒體電子傳遞鏈抑制劑CCCP都能使細(xì)胞線粒體膜電位去極化。(7)白蛋白攝取實(shí)驗(yàn)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察白蛋白穿胞的中間狀態(tài),結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)紅景天苷抑制白蛋白穿胞及穿胞的相關(guān)蛋白的作用。【結(jié)論】紅景天苷通過(guò)減少白蛋白跨GECs穿胞緩解蛋白尿的產(chǎn)生。高糖加重白蛋白穿胞的作用是通過(guò)上調(diào)ROS/Src/Cav-1途徑以及下調(diào)AMPK/Cav-1途徑實(shí)現(xiàn)的。紅景天苷阻止高血糖引起白蛋白穿胞的機(jī)制是通過(guò)其抗氧化效應(yīng)和激活A(yù)MPK的雙重作用實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

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