本文選題：系統(tǒng)性紅斑狼瘡 + DNA甲基化��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2015年碩士論文

【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一種常見的累及多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病。以DNA甲基化異常為核心的表觀遺傳學異常是SLE發(fā)病的主要因素。研究發(fā)現(xiàn),SLE患者T細胞中DNA甲基轉移酶-1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)基因表達及酶活性下調,CD70等基因的啟動子去甲基化導致相關基因過度表達。ERK信號轉導通路特異性抑制因子可抑制T細胞DNMT1基因表達及酶活性,從而引起與狼瘡T細胞類似的免疫紊亂,而該信號轉導通路缺陷正好也在狼瘡T細胞中存在。此外,細胞因子分泌和復雜調控網(wǎng)絡的異常是SLE免疫紊亂發(fā)生和各系統(tǒng)、器官的慢性炎癥及器官損害的直接原因。Th17細胞(T helper cell 17,輔助性T細胞17)通過其主要效應分子白介素(interleukin, IL)-17對SLE靶器官炎癥反應的增強作用,進而促進了靶器官的炎性損傷和SLE的發(fā)生發(fā)展。特別是SLE腎損害患者中,Th17細胞異�；罨⑶疫^度分泌IL-17起著重要作用。但是,SLE腎損害Th17細胞異�；罨头置贗L-17的確切機制還不完全清楚。近來的研究發(fā)現(xiàn),骨橋蛋白(Osteopontin, OPN)作為Th17細胞異�；罨脱仔砸蜃臃置诘闹匾{控器,在SLE疾病發(fā)生和靶器官炎性損傷中,特別是SLE腎損害中起著重要作用。第1部分ERK信號轉導通路在SLE患者表觀遺傳學基因表達調控機制研究背景以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學特征異常是SLE發(fā)病的重要因素。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)SLE患者T細胞DNMT1基因表達減少和酶活性下降,CD70、IL-6等基因啟動子甲基化程度降低,并導致該基因過度表達。SLE患者T細胞中ERK信號轉導通路缺陷可能在SLE表觀遺傳學特征異常中起關鍵作用。最近文獻報道,特異性ERK信號通路抑制劑可以抑制正常T細胞的DNMT1基因表達及酶活性并進而出現(xiàn)類似狼瘡T細胞的免疫異常,而ERK信號轉導通路活性降低正好也在狼瘡T細胞中存在。故推測SLE患者T細胞中ERK信號轉導通路缺陷可能在SLE表觀遺傳學特征異常中起關鍵作用。因此,我們擬利用流式、酶聯(lián)免疫、蛋白印跡、實時熒光定量PCR等技術研究體內狼瘡T細胞中ERK信號轉導通路和表觀遺傳學特征異常的內在聯(lián)系,用特異性ERK信號通路抑制劑、DNMT抑制劑處理T細胞研究體外ERK信號轉導通路對狼瘡T細胞表觀遺傳學特征的影響,從而進一步完善SLE發(fā)病機制中表觀遺傳學理論,為治療SLE提供新思路和新靶點。研究目的通過研究紅斑狼瘡患者體內ERK信號轉導通路與T淋巴細胞表觀遺傳學異常的內在聯(lián)系以及體外ERK信號轉導通路對正常人T淋巴細胞表觀遺傳學特征的影響,探討ERK信號轉導通路在以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學基因表達調控機制中的作用,進一步完善SLE發(fā)病機制中表觀遺傳學基因表達調控機制理論,為研究信號轉導通路對表觀遺傳學基因表達調控機制的影響提供新的思路,填補國內外研究的空白,也為系統(tǒng)性紅斑狼瘡這一自身免疫性疾病的治療提供新策略和新靶點。研究方法1.依據(jù)1997年修訂的SLE分類診斷標準,分別收集10例SLE患者作為實驗組和10例臨床資料匹配的健康體檢者作為對照組；2.收集實驗組和對照組外周血,先用Ficoll密度梯度離心法分離出單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用免疫磁珠(Immunomagnetic beads,IMB)分離技術分選CD4+T細胞,采用流式細胞技術(flow cytometry,, FCM)檢測分選的CD4+T細胞百分比；3.實驗組和對照組分選出的CD4+T細胞,分別用Trizol一步法和RIPA裂解液提取總RNA、DN、.蛋白質,儲存?zhèn)溆茫?.設計人ERK1、DNMT1和CD70PCR引物,將提取的總RNA經(jīng)逆轉錄RCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)擴增,分析基因mRNA表達水平；5. 以5甲基胞嘧啶作為DNA甲基化的生物標志物,利用印跡法DNA甲基化定量試劑盒(sigma, MDQ1, Amecica)檢測提取DNA的甲基化水平；6.用蛋白質印跡(Western blot)法檢測ERK1、DNMT1和CD70蛋白水平；7.采用IMB技術分離的人CD4+T細胞,分為ERK抑制組、DNNT抑制組、SLE和正常對照組共4組,分別加入特異性ERK抑制劑(U0126)、DNA甲基轉移酶抑制劑(氮雜胞苷)共培養(yǎng)72小時,而正常對照組未經(jīng)任何處理。后續(xù)實驗內容同前4、5和6。結果1.狼瘡T細胞中存在DNA甲基轉移酶表達下調和DNA低甲基化。SLE患者外周血T細胞的DNA甲基轉移酶基因1表達顯著低于健康對照組；2.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血T細胞過度表達甲基化調控基因CD70。我們用Western Blot、RT-PCR等方法發(fā)現(xiàn), SLE患者CD70表達水平較正常人顯著增加；3.DNA甲基化可以調控多種甲基化敏感基因表達。特異性DNA甲基化抑制劑氮雜胞苷與人外周血CD4+T細胞共培養(yǎng)可導致新合成的DNA甲基化水平明顯下降,DNA甲基化敏感基因CD70表達上調；4.狼瘡T細胞基因表觀遺傳學調控機制異常與ERK1信號轉導通路相關。選擇性有絲分裂原活化蛋白/細胞外信號調節(jié)激酶抑制劑U0126抑制正常T細胞ERK途徑,減少T細胞DNMT1 mRNA和蛋白表達水平,誘導DNA低甲基化,進而調控甲基化敏感基因CD70表達。結論以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學基因表達調控機制在SLE疾病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用第2部分ERK信號轉導通路在MRL/lpr鼠表觀遺傳學基因表達調控機制中的作用探討研究背景以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學特征異常是SLE發(fā)病的重要因素。我們的研究發(fā)現(xiàn)SLE患者T細胞DNMT1基因表達減少和酶活性下降,CD70、IL-6等基因啟動子甲基化程度降低,并導致該基因過度表達。最近文獻報道,特異性ERK信號通路抑制劑可以抑制正常T細胞的DNMT1基因表達及酶活性并進而出現(xiàn)類似狼瘡T細胞的免疫異常,而ERK信號轉導通路活性降低正好也在狼瘡T細胞中存在。故推測SLE患者T細胞中ERK信號轉導通路缺陷可能在SLE表觀遺傳學特征異常中起關鍵作用。因此,我們擬利用流式、酶聯(lián)免疫、蛋白印跡、熒光定量聚合酶鏈式反應等技術研究MRL/1pr鼠T細胞中ERK信號轉導通路和表觀遺傳學特征異常的內在聯(lián)系,用特異性ERK信號通路抑制劑、DNMT抑制劑處理T細胞研究體外ERK信號轉導通路對MRL/1pr鼠T細胞表觀遺傳學特征的影響,從而進一步完善SLE發(fā)病機制中表觀遺傳學理論,為治療SLE提供新思路和新靶點。研究目的通過研究MRL/1pr鼠體內ERK信號轉導通路與T淋巴細胞表觀遺傳學異常的內在聯(lián)系以及體外ERK信號轉導通路對T淋巴細胞表觀遺傳學特征的影響,探討ERK信號轉導通路在以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學基因表達調控機制中的關鍵作用,進一步完善SLE發(fā)病機制中表觀遺傳學基因表達調控機制理論,為研究ERK信號轉導通路對表觀遺傳學基因表達調控機制的影響提供新的思路。研究方法1.分別將10只MRL/lpr鼠和10只健康BALB/c小鼠作為動物實驗的實驗組和對照組；2.收集實驗組和對照組脾臟單個核細胞,用免疫磁珠分離技術分選鼠CD4+T細胞,采用流式細胞技術(flow cytometry, FCM)檢測所分選的CD4+T細胞百分比；3.采集鼠實驗組和對照組外周血,先用Ficoll密度梯度離心法分離出單個核細胞(PBMC),再用免疫磁珠分離技術分選鼠CD4+T細胞,分別提取總RNA、DNA、蛋白質,儲存?zhèn)溆茫?.設計小鼠ERK1、DNMT1和CD70引物,將提取的總RNA經(jīng)逆轉錄RCR擴增,分析各目的基因mRNA表達水平；5.以5甲基胞嘧啶作為DNA甲基化的生物標志物,利用印跡法DNA甲基化定量試劑盒(sigma, MDQ1,Amecica)檢測提取的DNA的甲基化水平；6.用蛋白質印跡(western blot)檢測ERK1、DNMT1和CD70蛋白水平；7.采用IMB技術分離的鼠CD4+T細胞,分為ERK抑制組、DNNT抑制組、SLE和正常對照組共4組,分別加入特異性ERK抑制劑(U0126)、DNA甲基轉移酶抑制劑(氮雜胞苷)共培養(yǎng)72小時,而正常對照組未經(jīng)任何處理。后續(xù)實驗內容同前4、5、6。結果1. MRL/1pr鼠T細胞中存在DNA甲基轉移酶表達下調和DNA低甲基化。MRL/1pr鼠外周血T細胞的DNA甲基轉移酶基因1表達顯著低于健康對照組；2. MRL/1pr鼠外周血T細胞過度表達甲基化調控基因CD70。我們用Western Blot、RT-PCR等方法發(fā)現(xiàn),MRL/1pr鼠CD70表達水平較健康對照組顯著增加;3.DNA甲基化可以調控多種甲基化敏感基因表達。特異性DNA甲基化抑制劑氮雜胞苷與MRL/1pr鼠外周血CD4+T細胞共培養(yǎng)可導致新合成的DNA甲基化水平明顯下降,DNA甲基化敏感基因CD70表達上調；4.狼瘡T細胞基因表觀遺傳學調控機制異常與ERK1信號轉導通路相關。選擇性有絲分裂原活化蛋白/細胞外信號調節(jié)激酶抑制劑U0126抑制正常T細胞ERK途徑,減少T細胞DNMT1 mRNA和蛋白表達水平,誘導DNA低甲基化,進而調控甲基化敏感基因CD70表達。結論以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學基因表達調控機制在SLE疾病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用第3部分骨橋蛋白在SLE腎損害Th17細胞異常中的作用研究背景系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種以多種炎性細胞因子參與的多靶器官損害為特征的自身免疫性疾病。特別是系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎損害,免疫復合物形成、免疫細胞和細胞因子等免疫異常導致的靶器官細胞浸潤和炎性損傷是其發(fā)病的關鍵因素。Th17細胞及其分泌的多種炎性細胞因子在SLE疾病的免疫紊亂及器官的炎性損傷中有非常重要的作用。有學者發(fā)現(xiàn),SLE患者外周血及受累器官Thl7細胞及IL-17均高表達。而且在SLE活動期其表達更高,而經(jīng)過治療后其表達有所降低。另外的學者則發(fā)現(xiàn),不僅SLE患者IL-17的分泌增加和分泌IL-17的CD4+和CD3 CD4 CD8T細胞增多,而且分泌IL-17的Th17細胞也存在于SLE患者炎性損傷的腎組織中。研究目的通過研究SLE腎損害患者OPN對CD3+CD8-IL-17A+T細胞及IL-17分泌的影響,探討OPN在SLE腎損害患者Th17細胞異常中的作用。方法分別取40例健康人和50例SLE患者(其中,伴腎損害SLE患者25例、無腎損害的SLE患者25例)血清和肝素鈉抗凝血,用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血清中OPN和IL-17的表達水平,用流式細胞術檢測外周血中CD3+CD8-IL-17A+T細胞的陽性率,并分析各組間差異,以及各因素間的相互關系。結果①SLE腎損害患者組的OPN、IL-17水平和CD3+CD8-IL-17A+ T細胞陽性率顯著高于無腎損害的SLE患者組、健康對照組,差異有統(tǒng)計學意義(F值分別為42.032,25.768,58.878,p均0.01)；無腎損害的SLE患者組和健康對照組間OPN、IL-17、CD3+CD8-IL-17A+T細胞陽性率的差異無統(tǒng)計學意義(F值分別為42.032,25.768,58.878,P均0.05)。②血清中OPN分泌與IL-17水平、CD3+CD8-IL-17A+T細胞陽性率之間成明顯正相關(R值分別為0.442、0.630,P值均0.01)。結論外周血中的OPN對SLE腎損害患者的Th17細胞異常起著重要的調控作用。
[Abstract]:Systemic lupus erythematosus ( SLE ) is one of the most common causes of systemic lupus erythematosus ( SLE ) . In order to provide new strategies and targets for the treatment of autoimmune diseases in systemic lupus erythematosus , 10 SLE patients were collected as experimental groups and 10 healthy subjects as control groups , according to the revised SLE classification criteria in 1997 .
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本文編號：1853427