本文選題：蛋氨酸　切入點(diǎn)：同型半胱氨酸　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：背景：同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)是蛋氨酸代謝途徑的中間代謝產(chǎn)物,高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia, HHcy)與心血管疾病、大腦認(rèn)知障礙、骨質(zhì)疏松和非酒精性脂肪肝密切相關(guān)。HHcy是動脈粥樣硬化的一個獨(dú)立危險(xiǎn)因素,近年來有關(guān)此方面的報(bào)道已有很多,但Hcy對非酒精性脂肪肝的影響及其分子機(jī)制尚不明確。本研究旨在采用蛋氨酸負(fù)荷的方法建立高同型半胱氨酸血癥動物模型,結(jié)合原代肝細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)以探討Hcy誘發(fā)肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的作用及分子機(jī)制。方法：選取4周齡健康雄性C57BL/6J小、鼠20只,隨機(jī)分為對照組(Control)和蛋氨酸組(Methionine),每組各10只；在自由進(jìn)食和飲水條件下,適應(yīng)性喂養(yǎng)14天至6周齡時(shí),對照組小鼠喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料,蛋氨酸組小鼠喂養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)飼料基礎(chǔ)上添加2%蛋氨酸飼料,持續(xù)喂養(yǎng)16周,每周記錄體重；對照組和蛋氨酸組動物在22周齡時(shí)處死,稱取肝臟、附睪周圍脂肪重量；收集血液進(jìn)行生化檢測,采用ELISA試劑盒測定血清Hcy水平；采用HE染色觀察肝細(xì)胞形態(tài)、脂質(zhì)沉積程度；Real-time PCR檢測肝臟組織目標(biāo)基因表達(dá)水平；Western Blotting檢測肝臟GRP78/BIP、PERK、p-PERK、eIF2a、p-eIF2a和nSREBP1c蛋白表達(dá)水平；原代肝細(xì)胞用高濃度Hcy、Met、PBA和TM處理后進(jìn)行油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)紅染脂質(zhì)數(shù)量；Real-time PCR檢測肝細(xì)胞目標(biāo)基因表達(dá)水平；Western blotting檢測原代肝細(xì)胞GRP78/BIP、PERK、 p-PERK、eIF2α、p-eIF2α蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：高蛋氨酸飲食對動物體重增長無顯著影響,但肝臟／體重比值和附睪周圍脂肪／體重比值均顯著高于對照組；肝臟組織切片H.E染色結(jié)果顯示蛋氨酸組小鼠肝組織出現(xiàn)顯著的肝細(xì)胞脂肪變性,血清AST、TG水平顯著增高,HDL水平顯著降低；Real-time PCR結(jié)果顯示蛋氨酸組小鼠肝臟組織CBS的mRNA表達(dá)水平較對照組明顯下調(diào)；Western blotting結(jié)果提示高蛋氨酸飲食組小鼠肝臟GRP78/BIP、活化的p-PERK、活化的p-eIF2a和成熟形式的n-SREBP-1c表達(dá)水平增高；油紅O染色結(jié)果表明原代肝細(xì)胞在同型半胱氨酸和衣霉素作用下發(fā)生明顯脂質(zhì)蓄積,PBA預(yù)處理后再加入同型半胱氨酸干預(yù)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積明顯減輕；Real-time PCR結(jié)果顯示原代肝細(xì)胞在同型半胱氨酸和衣霉素作用下GRP78、CHOP、FAS、ACClα和HMG-CoAr的mRNA表達(dá)水平較對照組明顯上調(diào),PBA預(yù)處理后再加入同型半胱氨酸干預(yù)肝細(xì)胞GRP78、FAS和ACC1α表達(dá)水平較同型半胱氨酸組明顯下調(diào),但CHOP和HMG-CoA r表達(dá)水平與同型半胱氨酸組無明顯變化；Western blotting結(jié)果提示原代肝細(xì)胞在同型半胱氨酸和衣霉素作用下GRP78/BIP、p-PERK和p-eIF2a蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),PBA預(yù)處理后再加入同型半胱氨酸干預(yù)肝細(xì)胞上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物蛋白表達(dá)明顯減弱。結(jié)論：高蛋氨酸飲食可通過升高血液中同型半胱氨酸水平導(dǎo)致肝臟發(fā)生脂肪變性。同型半胱氨酸可通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致肝臟脂肪變性。同型半胱氨酸水平升高可通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的活化,從而對肝臟脂質(zhì)代謝造成影響。
[Abstract]:Background: homocysteine (Homocysteine, Hcy) is the intermediate metabolite methionine metabolism, hyperhomocysteinemia (Hyperhomocysteinemia, HHcy) and cardiovascular disease, cognitive impairment, osteoporosis and nonalcoholic fatty liver is closely related to.HHcy is an independent risk factor for atherosclerosis, in recent years the related reports there are many, but the effect of Hcy on nonalcoholic fatty liver and its molecular mechanism is still unclear. Methods: This study aims to establish the methionine load homocysteine in animal models, combined with in vitro culture of primary hepatocytes to investigate the effects and molecular mechanisms of lipid metabolism disorders induced by Hcy liver. Methods: select healthy 4 week old male C57BL/6J were small, 20 rats were randomly divided into control group (Control) and methionine group (Methionine), 10 rats in each group; and in freedom. Under the condition of drinking water, fed for 14 days to 6 weeks of age, the control group of mice fed the standard diet, mice were fed with 2% methionine methionine feed with standard diet, lasting for 16 weeks, body weight was recorded weekly; the control group and the methionine group animal were sacrificed at 22 weeks old, weighing around liver, epididymal fat weight collect blood; biochemical test, serum Hcy levels were measured by ELISA kit; HE staining was used to observe the morphology of hepatocytes, lipid deposition; detecting liver tissue Real-time expression level of PCR gene; Western Blotting detection PERK, liver GRP78/BIP, p-PERK, eIF2a, p-eIF2a and nSREBP1c protein expression; primary hepatocytes with high concentration Hcy, Met, PBA and TM after treatment were observed in cells stained with oil red O stained red lipid quantity; Real-time PCR detection of liver cell target gene expression level; Western blotting The primary detection of liver cell GRP78/BIP, PERK, p-PERK, eIF2 alpha, the expression level of p-eIF2 protein. Results: high methionine diet had no significant effect on animal growth, but the liver / body weight ratio and epididymis around fat / body weight ratio were significantly higher than control group; liver tissue slices H.E staining showed that methionine group of mice liver tissue there is a significant fatty degeneration of liver cells, serum AST, TG levels were significantly increased, HDL levels decreased significantly; Real-time PCR showed that the expression level of methionine group of mice liver tissue CBS mRNA significantly decreased compared with the control group; Western blotting showed a high methionine diet group mouse liver GRP78/BIP, activation of p-PERK, increased the expression level of p-eIF2a and the activation of the mature form of n-SREBP-1c; oil red O staining results showed that hepatocytes in homocysteine and tunicamycin markedly lipid accumulation PBA, pre treated with homocysteine significantly reduce lipid accumulation in liver cells; Real-time PCR showed GRP78, primary hepatocytes in homocysteine and tunicamycin under the action of CHOP, FAS, the expression level of ACCl alpha and HMG-CoAr mRNA increased significantly compared with the control group, PBA pretreatment and then adding the same type cysteine intervention of liver GRP78 cells, the expression level of FAS and ACC1 alpha is homocysteine group significantly decreased, but CHOP and HMG-CoA expression of R and homocysteine group had no obvious change; Western blotting showed GRP78/BIP hepatocytes in homocysteine and tunicamycin, the expression of p-PERK and p-eIF2a protein significantly enhanced after pretreatment with PBA added homocysteine above liver cell markers of ER stress protein expression significantly decreased. Conclusion: high methionine diet by elevated blood homocysteine Cystine levels lead to liver fatty degeneration. Homocysteine can then lead to hepatic steatosis by expression of genes related to lipid metabolism activation induced by endoplasmic reticulum stress. Elevated homocysteine levels can live through the regulation of lipid metabolism in liver cells of the key transcription factor, resulting in hepatic lipid metabolism.

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R589

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