本文選題：CXC趨化因子受體4　切入點(diǎn)：間充質(zhì)干細(xì)胞　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:應(yīng)用經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后過表達(dá)CXCR4的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)通過玻璃體腔注射移植到糖尿病大鼠體內(nèi)后,觀察過表達(dá)CXCR4的BMSCs是否具有更好的治療作用,并探討其治療糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變可能的機(jī)制。方法:1.原代分離、培養(yǎng)BMSCs,并對(duì)其細(xì)胞免疫表型進(jìn)行鑒定。2.利用基因重組方法構(gòu)建慢病毒載體,將CXCR4目的基因轉(zhuǎn)染至第3代BMSCs,并進(jìn)行免疫熒光、Western-Blot、q-PCR檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)染后CXCR4基因在BMSCs中表達(dá)的情況;通過MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMSCs的增殖能力,觀察轉(zhuǎn)染CXCR4基因后BMSCs增殖能力是否有變化。通過transwell小室進(jìn)行BMSCs的趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè),觀察在SDF-1的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)染CXCR4基因后BMSCs遷移能力是否增強(qiáng)。通過流式細(xì)胞儀對(duì)BMSCs凋亡程度檢查,觀察轉(zhuǎn)染CXCR4基因后BMSCs凋亡程度是否有變化。3.將過表達(dá)CXCR4的第3代BMSCs移植到STZ誘導(dǎo)4w的糖尿病大鼠玻璃體腔體內(nèi),檢測(cè)各組移植前及移植后1w、2w、3w大鼠血糖、體重等大體情況。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:正常對(duì)照組(正常組)、糖尿病大鼠對(duì)照組(Blank組)、磷酸鹽緩沖液治療組(PBS組)、注射未經(jīng)處理BMSCs治療組(native組)、注射GFP病毒感染BMSCs治療組(GFP組)、注射CXCR4-GFP病毒感染BMSCs治療組(CXCR4組)。造模成功后進(jìn)行干預(yù)治療,其中PBS組、native組、GFP組、CXCR4組分別給予PBS、BMSCs、GFP-BMSCs、CXCR4-GFP-BMSCs玻璃體腔注射治療,正常對(duì)照組和Blank組不予特殊治療。注射后1w、2w、3w觀察各組視網(wǎng)膜石蠟切片HE染色病理組織學(xué)變化,western-blotting和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Rhodopsin、NSE及炎癥因子IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)變化,統(tǒng)計(jì)對(duì)比后得出結(jié)論。結(jié)果:1.從大鼠骨髓中易分離培養(yǎng)出BMSCs,細(xì)胞純度高、形態(tài)均一且具有典型MSC形態(tài)特征,表達(dá)MSC特異抗原標(biāo)志,體外擴(kuò)增能力強(qiáng)且能保持其低分化狀態(tài)和多向分化潛能;2.通過慢病毒轉(zhuǎn)染后,可過表達(dá)CXCR4基因。同時(shí)在MTS增殖能力檢測(cè)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),過表達(dá)CXCR4的BMSCs較正常的BMSCs和未轉(zhuǎn)染目的基因的GFP-BMSCs細(xì)胞增殖能力沒有明顯差異(p0.05)。在transwell趨化實(shí)驗(yàn)中,在SDF-1誘導(dǎo)下過表達(dá)CXCR4的BMSCs較正常的BMSCs和未轉(zhuǎn)染目的基因的GFP-BMSCs細(xì)胞遷移能力有明顯提高(p0.05)。通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡程度的檢查,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CXCR4的BMSCs較正常的BMSCs和未轉(zhuǎn)染目的基因的GFP-BMSCs細(xì)胞凋亡程度沒有明顯差異(p0.05)。3.和對(duì)照組相比,玻璃體腔移植CXCR4-BMSCs后視網(wǎng)膜炎癥程度明顯減輕;并且視網(wǎng)膜組織中Rhodopsin、NSE蛋白表達(dá)明顯升高,炎癥因子IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)明顯降低(P0.05)。結(jié)論:1、本研究在國內(nèi)外首次采用過表達(dá)CXCR4基因的BMSCs治療糖尿病大鼠模型,發(fā)現(xiàn)通過慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)CXCR4的BMSCs其趨化、歸巢能力明顯增強(qiáng),從而達(dá)到最大化的發(fā)揮外源性MSCs的治療作用。2、過表達(dá)CXCR4的BMSCs較普通BMSCs能更好的減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變炎癥反應(yīng),而且推斷其可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜出現(xiàn)相關(guān)蛋白的表達(dá),從而更好的發(fā)揮對(duì)視網(wǎng)膜損傷的修復(fù)作用。
[Abstract]:Purpose: To study the expression of CXCR4 after lentivirus transfection of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) by intravitreal injection of transplanted into diabetic rats, observed the therapeutic effect whether the expression of CXCR4 BMSCs is better, and to explore the possible treatment of diabetic retinopathy in rats. Methods: the mechanism 1. primary cultured BMSCs, separation, and the immunophenotype of.2. by using the method of identification of recombinant lentiviral vectors of CXCR4 gene transfection to the third generation of BMSCs, and immunofluorescence, Western-Blot, expression of CXCR4 gene in BMSCs transfected with q-PCR gene detection purposes after the experiment; the proliferation of MTS cells to detect the proliferation of BMSCs, observed after CXCR4 gene transfection BMSCs proliferation ability is changing. Chemotaxis assays were performed for detection of BMSCs by Transwell assay, observed in SDF-1 induced with CXCR4 gene After the migration ability of BMSCs is enhanced. Through the examination of the BMSCs degree of apoptosis by flow cytometry, observe the transfection of CXCR4 gene after BMSCs apoptosis whether there are changes in.3. over expressed CXCR4 third glass cavity generation BMSCs transplanted to STZ 4W induced diabetic rats were detected before and after transplantation, graft 1W, 2W. 3W rats blood glucose, body weight and general situation. Animal groups: normal control group (normal group), diabetic rats control group (group Blank), phosphate buffer treatment group (PBS group), untreated BMSCs injection treatment group (native group), injection of GFP virus infection in BMSCs treatment group (GFP group injection of CXCR4-GFP virus infection), BMSCs treatment group (group CXCR4) were treated. After the modeling, PBS group, native group, GFP group, CXCR4 group were given PBS, BMSCs, GFP-BMSCs, CXCR4-GFP-BMSCs intravitreal injection, normal control group and Blank group were not special The treatment. After injection of 1W, 2W, 3W were observed in retinal paraffin section HE staining histopathological changes, Rhodopsin were detected in rat retinal tissue Western-blotting and immunohistochemistry, NSE and inflammatory factor IL-6, expression of TNF- protein, statistical comparison of the results. Results: 1. from rat bone marrow in isolated BMSCs cells, high purity, uniform shape and has the typical characteristic of MSC, the expression of markers of MSC specific antigen, in vitro amplification ability and can maintain its low state of differentiation and differentiation; 2. by lentivirus transfection, expression of CXCR4 gene can be found in the MTS. At the same time the proliferation test, the expression of CXCR4 BMSCs compared to the normal BMSCs and there was no significant difference between the proliferative capacity of GFP-BMSCs cells without transfection of target gene (P0.05). In Transwell chemotaxis, induced by SDF-1 overexpression of CXCR4 is BMSCs Often BMSCs and GFP-BMSCs gene transfected cell migration ability has improved significantly (P0.05). The degree of apoptosis by flow cytometry examination found that overexpression of GFP-BMSCs apoptosis CXCR4 BMSCs compared to the normal BMSCs and untransfected gene were not significantly different compared to.3. (P0.05) and the control group vitreous inflammation, retinal transplantation significantly reduced after CXCR4-BMSCs; and Rhodopsin in retinal tissue, expression of NSE protein in IL-6, inflammatory cytokines, expression of TNF- protein decreased significantly (P0.05). Conclusion: 1. For the first time in this paper using BMSCs treatment of diabetic rats and expression of CXCR4 gene, discovered by slow transfection over expression of CXCR4 BMSCs and its chemotaxis and homing ability was enhanced, so as to maximize the therapeutic effects of exogenous MSCs.2, overexpression of CXCR4 BMSCs compared with ordinary BMSCs It can better reduce the inflammatory reaction of diabetic retinopathy, and infer that it can induce the expression of related proteins in retina, so as to better play the role of retinal damage repair.

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R587.2;R774.1

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本文編號(hào)：1620704