本文關鍵詞： 胰高血糖素 胰島素分泌 2型糖尿病 DAG-PKC信號通路　出處：《石河子大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:通過探討不同濃度的胰高血糖素(Glucagon,GC)及不同濃度葡萄糖(Glucose,Glu)刺激對胰島β細胞系MIN6細胞中胰島素(insulin,Ins)分泌的影響及對二脂酰甘油(Diacylglycerol,DAG)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)表達的影響,進一步明確GC對胰島素分泌的作用及機制。方法:1.對小鼠胰島瘤細胞株MIN6細胞進行體外培養(yǎng),生長到一定細胞密度之后進行傳代及分組,在不同Glu濃度即無糖(0mmol/L)、低糖(2.8mmol/L)及高糖(16.7mmol/L)和不同GC濃度即無GC(0ng/L)、低濃度GC(100ng/L)、中濃度GC(500ng/L)及高濃度GC(1000ng/L)的刺激作用下收集細胞培養(yǎng)皿中的上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測DAG濃度的水平;2.將敏感的熒光生物傳感器CKAR(PKC表達的質(zhì)粒)及陰性對照空質(zhì)粒PCDNA3.1采用真核細胞電穿孔的方法轉(zhuǎn)染入MIN6細胞中,在不同Glu及不同GC濃度刺激因素下采用基于熒光生物傳感器的熒光能量共振轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的技術觀察細胞熒光的變化從而實時測定細胞內(nèi)PKC含量的表達;3.采用ELISA法檢測細胞內(nèi)胰島素分泌的水平。結(jié)果:1.ELISA法檢測不同濃度Glu及不同濃度GC刺激下MIN6細胞上清液中DAG含量的結(jié)果如下:(1)在低糖和高糖濃度條件下,隨著GC濃度的升高,DAG含量也隨之升高,趨勢明顯,且高糖濃度下,DAG增加趨勢較低糖濃度下增加趨勢更加明顯;在無糖濃度條件下高濃度GC刺激下DAG濃度沒有隨GC濃度升高而升高的趨勢。(2)不同GC濃度組間進行比較:無糖條件下,中GC組DAG水平高于無GC組(P0.05);低糖條件下:高、中、低GC組DAG水平均高于無GC組(P0.05),高GC高于低GC組(P0.001),高GC組DAG水平高于中GC組(P0.001);高糖環(huán)境下:高、中GC組DAG水平均高于無GC組(P0.001),高GC組DAG水平高于低GC組(P0.001),高GC組DAG水平高于中GC組(P0.05)。2.基于熒光生物傳感器的FRET技術檢測MIN6細胞內(nèi)PKC含量的變化:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒:加入1000ng/LGC+16.7Glu處理組后與空白對照組kreb液相比CFP/YFP比值無明顯差異P0.05;轉(zhuǎn)染PKC質(zhì)粒CKAR后:(1)無糖時,在低濃度GC及中濃度GC刺激下,CFP/YFP比值曲線上升,曲線上升趨勢平緩,且中濃度GC刺激下較低濃度GC刺激下CPP/YFP比值差異明顯(P0.05);高濃度GC刺激后,CFP/YFP曲線沒有上升的趨勢。(2)在低糖條件下,給予低濃度及中濃度GC處理CFP/YFP比值曲線上升,上升趨勢平緩,且中濃度GC刺激較低濃度刺激時相比CFP/YFP比值差異明顯(P0.05);給予高濃度GC刺激后,CFP/YFP曲線繼續(xù)上升,上升趨勢較明顯,較低濃度GC及中濃度GC刺激階段相比比值升高(P0.05)。(3)在高糖條件下,給予低濃度及中濃度GC處理CFP/YFP比值曲線上升,上升趨勢平緩,給予高濃度GC刺激后,CFP/YFP曲線繼續(xù)上升,上升趨勢較明顯,較低濃度GC及中濃度GC刺激階段相比比值升高(P0.05)。3.ELISA法檢測不用濃度GC及不同濃度Glu刺激下MIN6細胞上清液中胰島素含量的結(jié)果如下:(1)在無糖,低糖,高糖濃度下,隨著GC濃度的增加,MIN6細胞胰島素分泌量也隨之增加,且隨著葡萄糖濃度由低到高,胰島素分泌量增加趨勢越明顯,在高糖濃度下,胰島素濃度增加趨勢最大。(2)不同GC濃度組間進行比較:無糖條件下,高、中、低GC組胰島素濃度均高于無GC組(P0.01),高GC組胰島素濃度高于低中GC組(P0.01);低糖條件下,高GC和中GC組胰島素濃度均高于無GC組(P0.01),高GC組高于低GC組(P0.01);高糖條件下,高GC和中GC組胰島素濃度均高于無GC組(P0.05),高GC和中GC組均高于低GC組(P0.01),高GC組高于中GC組(P0.01);結(jié)論:1.GC可能以濃度梯度的形式通過增加第二信使信號通路DAG-PKC通路中DAG及PKC含量從而增加MIN6細胞中胰島素的分泌。2.GC通過DAG-PKC通路增加胰島素分泌的作用具有一定的葡萄糖依賴性。
[Abstract]:Objective: To explore the effect of different concentrations of glucagon (Glucagon, GC) and different concentrations of glucose (Glucose, Glu) stimulation on MIN6 cell insulin in islet beta cell lines (insulin, Ins) and the secretion of two acyl glycerol (Diacylglycerol, DAG), protein kinase C (protein kinase C. PKC) on the expression of GC, to further clarify the role and mechanism of insulin secretion. Methods: 1. of mouse insulinoma cell line MIN6 cells were cultured in vitro, growth to after a certain cell density were passaged and grouped in different Glu concentration is sugar free, low sugar (0mmol/L) (2.8mmol/L) and high glucose (16.7mmol/L) and the different concentration of GC is GC (0ng/L), low concentration of GC (100ng/L), GC (500ng/L) concentration and high concentration of GC (1000ng/L) culture supernatant in the dish collection of cell stimulation, using enzyme-linked immunosorbent method (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) detection of DAG 嫻撳害鐨勬按騫，

本文編號：1554878