本文關(guān)鍵詞： INS-1細(xì)胞 硫氧還蛋白相互作用蛋白 自噬 凋亡　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:隨著人口老齡化的發(fā)展,慢性疾病的發(fā)生率顯著提高,其中糖尿病已成為威脅我國人民健康的最重要疾病之一。2010年楊文英和2013年寧光教授的研究均顯示,我國已取代印度成為全球糖尿病患者人數(shù)最高的國家,而且糖尿病的發(fā)病率仍呈快速上升趨勢,并向中青年,甚至兒童蔓延。不論1型或2型糖尿病,各種原因?qū)е碌囊葝uβ細(xì)胞數(shù)目減少和功能異常均是其發(fā)生和發(fā)展的重要原因。硫氧還蛋白相互作用蛋白(Trx interacting protein,TXNIP)在糖尿病的發(fā)病機制研究中的作用日益引起關(guān)注,它是目前已知唯一一個內(nèi)源性硫氧還蛋白(Trx)結(jié)合及抑制蛋白,在糖尿病患者血清和組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)。我們和他人課題組均研究證實了單純過表達(dá)TXNIP可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的途徑、死亡受體途徑和線粒體凋亡途徑引起INS-1細(xì)胞凋亡增高。自噬是在大部分真核細(xì)胞中經(jīng)常觀察到的一種生命現(xiàn)象,可以清除降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和不需要的生物大分子等以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),減少細(xì)胞凋亡并起到保護(hù)細(xì)胞的作用,但也有研究表明,自噬水平的過度激活可促進(jìn)凋亡的發(fā)生,而對器官組織造成額外的損傷。那么,TXNIP的升高對于自噬有何影響?其在TXNIP誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡中又有何作用?本研究將對這兩個問題進(jìn)行探討。目的:本實驗旨在運用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立TXNIP過表達(dá)INS-1胰島細(xì)胞模型,觀察正常培養(yǎng)條件下單純過表達(dá)TXNIP的INS-1胰島細(xì)胞自噬水平的變化,以及探討自噬在TXNIP誘導(dǎo)的INS-1胰島細(xì)胞凋亡中的作用。方法:1.使用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)對INS-1胰島細(xì)胞建立過表達(dá)TXNIP模型選用處于對數(shù)生長期的INS-1胰島細(xì)胞,在25cm×25cm的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),待細(xì)胞長滿視野范圍80%時細(xì)胞數(shù)量約為2×106個,棄掉培養(yǎng)基,PBS沖洗兩次倒掉,隨機分為3組,即正常培養(yǎng)組(Control),不含TXNIP的空載體腺病毒對照組(Ad-eGFP),含有TXNIP的過表達(dá)組(Ad-TXNIP-eGFP)。按感染復(fù)數(shù)MOI=50計算病毒量進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染,先將計算出的病毒體積加入1ml的1640中培養(yǎng)細(xì)胞,4h后補3ml含有10%胎牛血清和雙抗的1640繼續(xù)培養(yǎng),于48小時轉(zhuǎn)染效率最高時收集細(xì)胞。2.檢測指標(biāo)2.1應(yīng)用實時定量PCR和Western blot方法檢測INS-1胰島細(xì)胞TXNIP m RNA的水平以及蛋白表達(dá)量。2.2用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況。2.3應(yīng)用Western blot方法測定各組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、P62以及cleaved caspase 3/caspase 3的表達(dá)。2.4使用激光共聚焦顯微鏡觀察自噬體的變化。結(jié)果:1.INS-1胰島細(xì)胞過表達(dá)TXNIP成功與Control組相比,Ad-eGFP組TXNIP m RNA和蛋白水平未見明顯差別,與Ad-eGFP組相比,Ad-TXNIP-eGFP組TXNIP m RNA(圖1)和蛋白水平明顯增高(圖2),說明病毒構(gòu)建成功、病毒轉(zhuǎn)染目的蛋白造模成功。2.過表達(dá)TXNIP引起INS-1胰島細(xì)胞凋亡增加。使用Annexin V-APC/7-AAD染色經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡表明Ad-TXNIP-eGFP組細(xì)胞凋亡率增多:與Ad-eGFP組相比,Ad-TXNIP-eGFP組細(xì)胞凋亡率增多,而Ad-eGFP組與Control組無明顯差異(圖4)。Ad-TXNIP-eGFP組cleaved caspase 3/caspase 3比值增高:cleaved caspase 3的生成是凋亡的共同通路,與Control組相比,Ad-eGFP組cleaved caspase 3/caspase 3比值未見統(tǒng)計學(xué)差異;與Ad-eGFP組相比,Ad-TXNIP-eGFP組顯著增高(圖3),進(jìn)一步證實了TXNIP的上調(diào)可引起INS-1胰島細(xì)胞的凋亡增加。3.TXNIP表達(dá)上調(diào)可引起INS-1胰島細(xì)胞自噬水平的升高。與Control組相比,Ad-eGFP組的自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平、Beclin-1蛋白水平未見明顯差別,與Ad-eGFP相比,Ad-TXNIP-eGFP組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平是升高的(圖5),Beclin-1蛋白水平也增多(圖6),二者增多說明自噬反應(yīng)生成增多。由于P62是自噬降解的底物,隨自噬的加強,其水平逐漸降低,是自噬檢測的常用標(biāo)志物,與Control組相比,Ad-eGFP組P62蛋白水平未見統(tǒng)計學(xué)差異,與Ad-eGFP組相比,Ad-TXNIP-eGFP組P62蛋白水平降低(圖7),表明自噬溶酶體降解增多,自噬反應(yīng)增多。4.激光共聚焦顯微鏡下觀察到Ad-TXNIP-eGFP組自噬體增多使用LC3B多克隆抗體對自噬細(xì)胞進(jìn)行染色,共聚焦顯微鏡下攝片并分析:Control組和Ad-eGFP組之間染色所呈的紅色熒光無顯著差別,均很弱;與Control組和Ad-eGFP組相比,Ad-TXNIP-eGFP組自噬熒光顯著增強,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了明顯的紅色熒光,表明過表達(dá)TXNIP促進(jìn)自噬體生成(圖8)。5.3-MA(5m M)抑制自噬后TXNIP上調(diào)引起的INS-1胰島細(xì)胞凋亡減少。5.1 3-MA(5m M)抑制了TXNIP上調(diào)引起的INS-1胰島細(xì)胞自噬水平的升高。為了證實自噬的改變在TXNIP上調(diào)引起的INS-1胰島細(xì)胞凋亡中的作用,采用了自噬抑制劑3-methyladenine(3-MA)進(jìn)行干預(yù),將細(xì)胞進(jìn)一步分組為:Control組、Ad-eGFP組、Ad-TXNIP-eGFP組、Control+3-MA組、Ad-eGFP+3-MA組、Ad-TXNIP-eGFP+3-MA組,對前述幾個自噬標(biāo)志物的檢測結(jié)果顯示:Control+3-MA與Control組相比無統(tǒng)計學(xué)差異;Ad-eGFP+3-MA組與Ad-eGFP組相比也無統(tǒng)計學(xué)差異;與Ad-TXNIP-eGFP組相比,Ad-TXNIP-eGFP+3-MA組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低(圖9),Beclin-1表達(dá)明顯降低(圖10),而P62表達(dá)明顯增多(圖11),以上結(jié)果說明,3-MA抑制了TXNIP過表達(dá)誘導(dǎo)的自噬發(fā)生。5.2自噬抑制后TXNIP上調(diào)引起的INS-1胰島細(xì)胞凋亡減少。使用Annexin V-APC/7-AAD染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡的結(jié)果顯示:Control+3MA組與Control組相比無統(tǒng)計學(xué)差異;Ad-eGFP+3-MA組與Ad-eGFP組相比無統(tǒng)計學(xué)差異;Ad-TXNIP-eGFP+3-MA組與Ad-TXNIP-eGFP組相比INS-1細(xì)胞凋亡減輕(圖13)。使用Western blot對cleaved caspase 3/caspase 3的檢測也取得類似結(jié)果,Ad-TXNIP-eGFP+3MA組cleaved caspase 3/caspase 3比值明顯降低(圖12),同樣表明使用自噬抑制劑后,TXNIP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減輕。結(jié)論:1.在INS-1細(xì)胞單純過表達(dá)TXNIP可以誘導(dǎo)自噬增加;2.TXNIP誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞自噬可以增加細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1471809